CD4阳性T细胞分泌的Bcl2L12蛋白在小儿溃疡性结肠炎中促进Th2细胞活化对疾病进展的影响

赵玉霞 刘迎春 张细元 梅 红

(华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院消化内科，武汉 430016)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是炎症性肠病的一种类型，近年来，国内儿童UC的患病率逐年上升，引起儿科临床的高度重视。UC的发病机制目前尚不清楚，病理学研究发现结肠黏膜中单核细胞深度浸润，Th2细胞分泌过量的促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、IL-17、IL-4、IL-5 和IL-13等，与UC的严重程度密切相关[1]。免疫失调是炎症性肠病的重要致病因素[2]，其中Th2或Th17活化在UC的发病机制中起关键性作用[3]。但其在肠道中介导Th2活化的机制目前尚未清楚。有研究发现Bcl2样蛋白12(Bcl2 like protein 12，Bcl2L12)在免疫失调发病过程中起到重要作用[4]。Bcl2L12属于Bcl2家族，是抗凋亡分子之一[5]，能够抑制P53并促进细胞存活[6]。但Bcl2L12蛋白在小儿UC发病中的作用目前尚无报道。因此本研究主要探讨CD4+T细胞分泌的Bcl2L12在介导Th2活化过程中的机制。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1研究对象 按照《儿童炎症性肠病诊断规范共识意见》诊断标准[7]，纳入2015年1月～2017年12月于我院初诊的20例UC患儿，并以同期20例性别、年龄匹配的健康儿童作为对照组。UC组和对照组均符合以下标准：①无自身免疫性疾病；②近3个月内无感染史；③近3月内无激素、免疫抑制剂及生物制剂用药史。本研究经本院伦理委员会审核通过，所有患儿及对照组亲属知情同意。UC患儿及对照组的一般资料见表1。

表1 UC组和健康对照组的临床资料

1.1.2实验动物 CD4+T细胞中Bcl2L12特异性敲除小鼠(Bcl2L12-KO)及其对照C57BL/6J野生型小鼠(WT)均购自武汉大学实验动物中心，并饲养于无菌动物饲养室。

1.2方法

1.2.1外周血标本收集及血清、PBMC分离 在无菌条件下抽取外周静脉血10 ml，其中2 ml置于离心管中，静置30 min后以500 r/min离心5 min，取上清储存于-80℃冰箱中；另外8 ml经肝素抗凝后于2 h内通过密度梯度离心法收集外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。

1.2.2血清炎症因子检测 ELISA法分别检测的血清中Th2细胞活化因子IL-4、IL-5和IL-13及Bcl2L12水平(试剂盒购自BD公司)。

1.2.3流式细胞术检测Th2细胞 在PBMC悬液中加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗CD4抗体和PE标记的抗IL-4抗体测定Th2细胞，CD4+IL-4+双阳性细胞即为Th2细胞。

1.2.4UC造模 取4周龄WT和Bcl2L12-KO各20只，每组选取10只小鼠自由饮用3%的硫酸葡聚糖(dextran sulphate sodium，DSS)连续7 d，作为UC模型组；其余10只小鼠正常饮用水，无DSS添加，作为对照组。第8天时处死小鼠，进行后续实验。

1.2.5小鼠体重测定 在造模期间，每日观察小鼠的精神状态、毛色、进食及粪便情况，并记录体重。

1.2.6结肠长度测定 实验第8天，处死小鼠后取结肠至肛门直肠段，测量并记录自然长度。

1.2.7结肠HE染色及病变评分 取小鼠结肠组织，用生理盐水冲洗后，置于4%多聚甲醛中，于室温下固定12 h以上，经脱水、石蜡包埋后连续切片，进行苏木素-伊红(HE)染色。结肠组织的炎症病理评分标准如下：肠壁炎症严重程度分为轻度1分、中度2分、重度3分；病变严重程度分为病变位于黏膜层1分、黏膜和黏膜下层2分、透壁性损害3分；隐窝损害程度分为轻度1分、中度2分、隐窝缺失但上皮完整3分、隐窝表面上皮都缺失4分。将上述3项指标相加即为最后得分。

1.2.8血清炎症因子和Th2细胞比例测定 血清炎症因子测定同1.2.2；外周血PBMC中Th2细胞比例测定同1.2.3。

1.2.9结肠组织中Th2凋亡细胞检测 取病变所在部位结肠，经胶原酶Ⅳ水解单细胞化后，加入FITC标记的抗CD4抗体和PE标记的抗IL-4抗体测定Th2细胞，APC标记的Annexin V和PI染料，通过流式细胞术检测病变结肠组织中Th2凋亡细胞(以Annexin V+PI-为特征)占总Th2细胞的比例。

1.2.10Western blot检测Th2细胞中Bcl2L12蛋白水平 分离Bcl2L12-KO和WT小鼠脾脏中的Th2细胞，加入细胞裂解液，离心10 min后取上清，沸水浴3 min使蛋白充分变性，Western blot法检测Bcl2l12-KO和WT小鼠Th2细胞中Bcl2L12蛋白的表达，从而验证Bcl2L12敲除效率。以β-actin作为参照。

2 结果

2.1UC患儿血清中Th2相关炎症因子水平 UC患儿血清中IL-4水平[(20.67±3.55)μg/ml vs (4.78±1.38)μg/ml，P<0.001]、IL-5水平[6.95 μg/ml vs (2.71±1.27)μg/ml，P<0.05]和IL-13水平[(49.73±13.57)μg/ml vs (21.50±4.81)μg/ml，P<0.01]均明显高于对照组(图1A-C)。通过流式细胞数分析外周PBMC中Th2细胞比例发现，UC患儿PBMC中Th2细胞比例显著高于对照组[(4.39±2.04)% vs (1.05±0.62)%,P<0.01](图1D)。

2.2UC患儿血清BCL2L12蛋白水平 UC患儿血清中BCL2L12蛋白水平显著高于对照组[(46.04±13.42)μg/ml vs (12.44±4.88)μg/ml，P<0.01](图1E)。

图1 UC患儿与对照组的血清Th2相关炎症因子及BCL2L12蛋白水平比较Fig.1 Serum Th2-related inflammatory factors and BCL2L12 protein levels in children with UC and controls

2.3Bcl2L12对UC进展的影响 Bcl2L12-KO小鼠的外周血Th2细胞不表达Bcl2L12蛋白(图2A)。通过DSS诱导UC后发现，Bcl2L12-KO小鼠的结肠炎症程度弱于WT小鼠(图2B)。进一步通过炎症评分证实Bcl2L12-KO小鼠经DSS诱导后的炎症评分显著低于WT小鼠[(2.4±0.8 )vs (8.4±1.4)，P<0.01](图2C)。此外，Bcl2L12-KO小鼠在DSS诱导后体重降低程度明显低于WT小鼠(P<0.01)(图2D)，且结肠长度长于WT小鼠(P<0.01)(图2E)。

2.4Bcl2L12对Th2细胞炎症因子分泌的影响 Bcl2L12-KO小鼠经DSS诱导后，外周血中的Th2细胞比例显著低于WT小鼠[(10.1±2.9)% vs (23.2±3.8)%，P<0.01](图3A)。 同时， Bcl2L12-KO小鼠血清中IL-4[(5.39±1.42)μg/ml vs (18.44±4.21)μg/ml，P<0.001]、IL-5[(2.41±0.92)μg/ml vs (8.73±1.40)μg/ml，P<0.01]、IL-13[(12.59±4.31)μg/ml vs (43.52±12.40)μg/ml，P<0.05]和Bcl2L12蛋白水平[(0.32±0.19)μg/ml vs (58.21±12.42)μg/ml，P<0.001]均显著低于WT小鼠(图3B～E)。未经DSS诱导的Bcl2L12-KO和WT小鼠外周血中Th2细胞比例、IL-4、IL-5、IL-13水平无统计学差异(P>0.05)(图3A～D)。

图2 Bcl2L12-KO与WT小鼠的UC造模Fig.2 UC model in Bcl2L12-KO and WT mice

图3 Bcl2L12-KO与WT小鼠的血清Th2相关炎症因子及BCl2L12蛋白水平比较Fig.3 Comparison of serum Th2-related inflammatory factors and BCl2L12 protein levels in Bcl2L12-KO and WT mice

图4 Bcl2l12-KO与WT小鼠结肠组织中Th2细胞凋亡情况Fig.4 Apoptosis of Th2 cells in colon tissues of Bcl2l12-KO and WT mice

2.5Bcl2L12对Th2细胞凋亡的影响 经DSS诱导后，Bcl2L12-KO小鼠的Th2凋亡细胞比例显著高于WT小鼠[(29.1±4.3)% vs (8.4±2.3)%，P<0.001]，但未经DSS诱导的Bcl2L12-KO和WT小鼠的结肠组织中Th2凋亡细胞比例无统计学差异(图4)。

3 讨论

UC是发生于结肠黏膜中的慢性炎症，其致病因素目前仍无定论。有研究发现结肠中对食物过敏源的偏态反应，而这种反应被认为是食物蛋白诱导的肠道炎症综合征或非IgE介导的食物过敏[8]。也有研究表明，合并有IgE介导的食物过敏的UC患者对过敏原特异性免疫治疗反应良好[9]。而目前的理论认为Th2偏向性炎症反应是过敏性疾病的主要特征之一。而本研究也发现了UC患儿外周血中Th2细胞比例增多，提示了UC患儿处于Th2偏向性炎症反应状态。

Th2活化介导的炎症反应以Th2细胞深度浸润和局部组织中高水平的Th2细胞因子的分泌为主要特征，包括IL-4、IL-5和IL-13，其中IL-4是Th2细胞分子的特征性因子[10]。IL-4介导B细胞中的IgE同型转换而促进IgE的分泌[11]。目前有多项研究探讨了Th2炎症反应在UC发病机制中的作用。Melgar等[12]发现UC患者的结肠黏膜中Th2细胞比例降低，但Rosen等[13]则发现UC患者的血清中Th2细胞因子(IL-5和IL-13)的水平显著升高，并且与UC的结肠黏膜愈合密切相关。尽管目前认为Th2细胞因子对机体本身具有适当的保护性作用，但Th2细胞因子的过量分泌也将介导多种疾病的发生和进展[14]。本研究也发现UC患儿血清Th2细胞因子水平显著高于对照组儿童，这与Rosen等[13]的结论一致。

尽管Th2细胞因子参与慢性炎症疾病的发生已被充分认可，但驱动Th2细胞因子过量分泌的机制目前尚不清楚。本研究结果表明，CD4+T细胞合成并分泌的Bcl2L12蛋白在介导Th2偏向性的炎症反应中起重要作用，提示Bcl2L12蛋白与UC的发生相关。Bcl2L12是BCL2家族成员之一，参与细胞凋亡的调节。早期研究表明胶质瘤细胞、肝脏和血管内皮细胞等均可合成并分泌Bcl2L12蛋白[15]。本研究发现CD4+T细胞可以合成和释放Bcl2L12蛋白。Bcl2L12的表达能够抑制抑癌基因P53、胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7的表达从而抑制细胞凋亡[16]。本研究发现Bcl2L12敲除小鼠在UC造模后结肠组织中凋亡的Th2细胞比例显著低于野生型小鼠，这也提示了Bcl2L12蛋白在抑制Th2细胞凋亡方面的作用。本研究还发现Bcl2L12敲除小鼠经UC造模后，其体重下降程度、结肠缩短程度均明显低于野生型小鼠，且Bcl2L12敲除小鼠结肠组织的炎症严重程度和炎症评分均明显低于野生型小鼠，血清中Th2细胞因子水平和Th2细胞比例也显著低于野生型小鼠。由于本研究采用的是CD4+T特异条件性Bcl2L12敲除的小鼠模型，直接提示了CD4+T细胞分泌的Bcl2L12在参与Th2细胞活化从而促进UC进展中的作用。

综上所述，本研究证实了小儿UC患儿血清中Bcl2L12和Th2细胞因子水平显著升高，处于Th2偏向性炎症反应状态。通过小鼠模型证实了CD4+T细胞分泌的Bcl2L12蛋白能够抑制Th2细胞的凋亡，从而促进Th2细胞的活化、刺激Th2细胞因子的分泌并促进UC疾病的进展，为UC的治疗提供新的靶点。