基于UPLC-Q-TOF-MS 分析酵母对葡萄酒中糖苷态香气物质释放的影响

安效辉，苗瀛心，陈 倬，张欣珂，段长青，潘秋红*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，葡萄与葡萄酒研究中心，农业农村部葡萄酒加工重点实验室，北京 100083）

葡萄果实直接为葡萄酒提供品种香，包括萜烯类、降异戊二烯类、芳香族类、脂肪族类、吡嗪类香气物质等[1]。这些香气物质按照其挥发性可以分为游离态和结合态。结合态香气物质不具有挥发性，没有直接的香气贡献，通常被称为香气前体物，但它们可以在葡萄酒发酵和陈酿过程中，被酵母糖苷酶水解或葡萄酒环境酸水解，转变为有挥发的、可感知的游离态香气物质[2]，进而共同贡献于葡萄酒的品种香气。由于结合态香气物质在葡萄果实总香气物质中占有很大的比例，因此，这类物质是酿酒葡萄原料中潜在的极为重要的香气组分，对葡萄酒品质起着重要作用[3]。

结合态香气物质根据其结合方式的不同可分为两大类，一类是与单糖或双糖键合形成的糖苷态，另一类是与氨基酸或小分子肽以硫键的形式结合的前体物[3]。糖苷态香气物质的结构分为两部分，一部分是具有挥发性的配基，另一部分是糖苷配体，二者通过β-糖苷键连接[1]。挥发性配基主要是单萜、降异戊二烯等香气化合物，糖苷配体主要有单糖苷和二糖苷，单糖苷通常是β-D-吡喃葡萄糖苷，双糖苷主要是己糖基-葡萄糖苷，如6-O-α-L-吡喃鼠李糖苷-β-D-吡喃葡萄糖苷即芸香糖苷，也有戊糖基-葡萄糖苷，如6-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷、6-O-α-L-呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷[4-6]。也有文献报道鉴定到了单萜三糖苷，以己糖基-戊糖基-己糖苷的形式存在[7]。糖苷态香气前体物转化为游离态物质的最终浓度，主要取决于葡萄果汁中糖苷态香气前体物的浓度、发酵中酵母糖苷态酶的活性、贮藏过程中的葡萄酒pH值和温度等[3]。

糖苷态香气前体物在葡萄酒发酵过程中分解方式主要为酶解[8]，通过糖苷酶释放香气配基可以是一步反应也可以是连续反应。单糖苷可以通过β-葡萄糖苷酶裂解释放，而二糖苷或三糖苷则需要特定的水解酶降解糖苷键，往往先顺序断裂末端的戊糖或己糖，最后裂解O-葡萄糖苷键。不过也存在一步切开糖苷键的双糖苷酶，如β-葡萄糖苷内切酶[9]。在发酵过程中，发酵带来的香气可以补充品种的香气[10]，酵母中的糖苷酶对葡萄酒香气的提升具有十分重要的作用[11]，且不同菌株在发酵条件下的相对酶活性和特异性底物会有所差异[12-14]，因此，酿酒时所用酵母菌株的不同也会影响到葡萄酒的感官香气和酒体风格，酿酒师可以通过选用不同的酵母菌株对葡萄酒的整体香气进行微调[15]。

已有研究在许多不同葡萄品种中都检测到了糖苷结合态香气物质存在[16-18]。糖苷结合态香气物质的检测通常采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用的方法，即先固相萃取糖苷态香气物质，接着用糖苷水解酶（如AR2000）或添加盐酸进行水解，得到挥发性配基，采用GC-MS对香气配基进行定性和定量分析[19]。样品处理所采用的酸解法和酶解法都存在一定的局限性，酸解法中萜烯物质会发生分子重排，导致物质结构改变[20]；而酶解法存在酶解不充分的问题，测得的水解产物不能完全代表结合态香气物质的天然存在形式[21]。也有研究利用液相色谱-高分辨率质谱和二级质谱研究葡萄中的糖苷态香气物质[7,22-23]。相比之下，超高效液相色谱技术具有更好的稳定性和灵敏度，拥有更好的定性能力，且已经广泛应用于肉类、乳类药物残留检测等食品安全检测领域[24-25]。利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间-质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight-mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）法检测糖苷态香气物质，不会改变其配基和糖苷的组成，能够检测到物质原有的结构形式，可以更好地反映糖苷态香气物质的含量及其变化，避免水解样品带来的弊端。TOF的精确质量检测可对物质进行精准的推测，进而结合MS/MS检测结果鉴定物质的结构[2,26]。实验室在前人研究方法的基础上[7,22]，建立葡萄果实主要糖苷态香气物质质谱信息库。本实验采用UPLC-Q-TOF-MS方法，研究2 种酵母Red Fruit和Zymaf l ore ST分别在‘北冰红’冰酒和‘威代尔’冰酒的发酵过程中，对糖苷态香气前体物含量的影响，以及瓶储1 年后葡萄酒中糖苷态香气前体物含量的变化，从而评价酵母对糖苷态香气物质释放的效应。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

所有样品均取自吉林通化集安市鸭江谷酒庄。

Zymaf l ore ST酵母 法国Laffort公司；Red Fruit活性干酵母、Extra Zym果胶酶 意大利Enartis公司。

1.2 仪器与设备

RE-52旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；HX-250恒温循环器 北京博医康实验仪器有限公司；SHB-IIIA循环水式多用真空泵 上海振捷实验设备有限公司；SHZ-DIII循环水式真空泵 天津奥特塞恩斯仪器有限公司；Agela负压真空固相萃取装置 天津博纳艾杰尔科技有限公司；1290 Infinicty II UPLC-Q-TOF（6545 Q-TOF）-MS仪 美国安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冰酒发酵流程及取样

发酵流程：对已达到理论成熟度后70 d的‘北冰红’葡萄和‘威代尔’葡萄果实，在-13 ℃条件下人工采收，通过振动分选台进行穗选，用框式压榨机压榨，得到的葡萄汁经在线添加90 mg/L SO2，入罐至450 L发酵罐，让其自然沉淀，并向其中添加果胶酶，6 ℃澄清3 d，分离清汁，待回温至12 ℃后接种酵母，接种量为30 g/（h·L），发酵温度控制在12～14 ℃之间，发酵结束（约42 d）后将温度降低至0 ℃以终止乙醇发酵。倒罐，澄清过滤，过滤后添加100 mg/L SO2。稳定过滤后，用GAI灌装线，装瓶于375 mL瓶中，打入天然软木塞。贮藏于相对湿度60%～70%，温度（16±1）℃的酒窑中。‘北冰红’品种每种酵母做2 个重复，而‘威代尔’每种酵母做1 个重复，共6 个发酵罐。

取样方法：接种酵母前（葡萄汁）取样1 次，葡萄发酵液比重每下降0.02取样一次，发酵结束后取样一次，每个发酵罐每次取样500 mL于矿泉水瓶中。对用Red Fruit发酵的‘北冰红’冰酒在过滤和瓶储1 年后各取样1 次。所有样品均于-40 ℃条件下贮藏待用。

1.3.2 糖苷态香气物质的固相萃取

用10 mL甲醇（分析纯）和10 mL纯净水依次活化Cleanert PEP-SPE固相萃取柱，将2 mL冰酒样品加入活化后的萃取柱中，依次用2 mL水和5 mL二氯甲烷分别洗涤低分子质量的糖、酸等极性化合物和游离态的非极性香气化合物，最后用20 mL甲醇洗脱并收集糖苷态香气前体物。将洗脱液置于蒸馏烧瓶中，30 ℃真空旋转蒸发至干，用2 mL甲醇（优级纯）复溶，充分摇匀。取1 mL提取液，加入10 µL内标（100 mg/Ln-辛基-β-D-葡萄糖苷），最后用0.22 μm有机相滤膜过滤待用。

1.3.3 糖苷态香气物质的检测

使用UPLC-Q-TOF-MS检测各种糖苷态香气物质的含量。

UPLC条件：Agilent SB C18RRHD色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相为含0.1%甲酸溶液（A相）和含0.1%甲酸的乙腈（B相）；流速0.4 mL/min；柱温35 ℃；进样量5 µL；梯度洗脱：0～40 min，5%～95% B。

QTOF检测条件：采用Dual AJS电子电离源，负离子模式；每个循环采集3 个母离子；一级质谱（MS）采集范围m/z100～900；二级质谱（MS/MS）m/z20～600；采集频率4 sprctra/s；鞘气（氮气）流速10 L/min，400 ℃；干燥气（氮气）流速8 L/min，350 ℃；雾化气压60 psig；喷嘴电压1 kV；毛细管电压3.5 kV。使用标准混合物（调谐液）G1969-85000（Supelco Inc.）进行负质量校准，并且预期质量偏差为±0.2×10-6，校准物质为三氟乙酸铵（m/z112.985 6）和三氟乙酸阴离子加合物（m/z1 033.988 1）。

1.3.4 糖苷态香气物质的定性定量分析

通过样品的二级质谱信息与个人化合物数据库和谱库（PCDL库）进行比对，找到具有一定断裂规律的物质进行定性分析。由于目前可购得的糖苷态香气物质标准品很少，而且戊糖中的阿拉伯糖、芹菜糖、木糖等化合物均具有相同分子式，大部分单萜组分也有相同的分子式且结构极为相似，在相同的碰撞能量下，同一类化合物的断裂情况也极为相似，所以本研究只对物质进行种类的定性分析，根据各物质进行相对定量。

1.4 统计学分析

由于固相萃取效率会对实验结果产生一定影响，每个取样做2 个萃取重复，每个重复上机做2 个测定平行。采用SPSS统计软件ANOVA进行显著性分析；采用Origin Pro 9.0软件绘图；测定结果以 ±s表示。

2 结果与分析

2.1 ‘威代尔’和‘北冰红’冰酒的主要理化指标

表1 ‘北冰红’和‘威代尔’冰酒的主要理化指标Table 1 Physicochemical parameters of ‘Beibinghong’ and‘Vidal’ ice wines

2 种冰酒均采用450 L发酵罐进行发酵，如表1所示，2 种酵母发酵结束的‘北冰红’冰酒中，残糖质量浓度分别为（225.00±12.50）g/L和（212.50±35.36）g/L结束，乙醇体积分数分别为（8.79±0.81）%和（7.66±0.12）%；而‘威代尔’冰酒中，残糖质量浓度分别为（162.50±12.50）g/L和（150.00±35.36）g/L，乙醇体积分数分别达到（7.2 3±0.8 1）%和（7.43±0.12）%；‘威代尔’冰酒中可滴定酸含量高于‘北冰红’，2 种冰酒的挥发酸质量浓度在1.33～1.56 g/L之间，符合GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》要求。

2.2 2 个品种葡萄汁中糖苷态香气物质种类的比较

2 个品种的葡萄汁中共检测出30多种不同的糖苷态香气前体物质，其中单萜二醇-戊糖基葡萄糖苷（C21H36O11）、单萜醇-戊糖基葡萄糖苷（C21H36O10）等都检测到不同的组分，在葡萄果实中，单萜醇有里那醇、香叶醇、香茅醇、橙花醇、α-萜品醇等物质，戊糖基也有阿拉伯糖基、木糖苷、芹菜糖苷等，它们有相同的分子式且结构相似，在相同碰撞能量下，同类化合物（如单萜二醇-戊糖苷葡萄糖苷）有极其相似的断裂情况，难以确定具体的化合物，但可以通过保留时间进行组分的区分。如表2所示，‘威代尔’葡萄汁糖苷态香气物质的种类较‘北冰红’更为丰富，在‘威代尔’中可检测到2 个葡萄糖苷、24 个戊糖基-葡萄糖苷和5 个己糖基-葡萄糖苷组分，而在‘北冰红’中只检测到11 个戊糖苷-葡萄糖苷和6 个己糖苷-葡萄糖苷组分，说明‘北冰红’冰酒的香气潜力相对较弱，这印证了前人的研究结果[27]。

表2 ‘威代尔’和‘北冰红’葡萄汁中糖苷态香气物质的种类Table 2 Composition of glycosidically bound aroma compounds in‘Vidal’ and ‘Beibinghong’ grape juices

2.3 ‘北冰红’冰酒发酵过程中2 种酵母对糖苷态香气物质释放的影响

2.3.1 对不同糖苷类型的香气物质含量的影响

图1 酵母Red Fruit和Zyma flore ST发酵的‘北冰红’冰酒过程中不同糖苷类型香气物质的变化（n=8）Fig. 1 Variations in various aroma glycoside compounds during fermentation of ‘Beibinghong’ ice wine by Red Fruit or Zyma flore ST (n = 8)

如图1所示，‘北冰红’葡萄汁在Red Fruit或Zymaflore ST酵母发酵下，戊糖基-葡萄糖苷类香气物质的含量均逐渐下降，相比之下，Zymaf l ore ST酵母发酵的冰酒中，戊糖基-葡萄糖苷的下降较为明显，表明该酵母中水解戊糖基-葡萄糖苷的酶活性较高。己糖基-葡萄糖苷类香气物质的含量在Zymaf l ore ST酵母发酵过程中无显著变化，在Red fruit酵母发酵过程中甚至有所增加，说明2 种酵母对‘北冰红’葡萄汁中己糖基-葡萄糖苷香气物质的水解释放作用较小，相应的水解酶活性较低。总体上，Zymaf l ore ST酵母和Red Fruit酵母对‘北冰红’发酵过程中糖苷态香气物质的影响有限。

表3 ‘北冰红’冰酒发酵过程中各类糖苷态香气物质质量浓度的变化Table 3 Variation in various aroma glycosides compounds during ‘Beibinghong’ ice wine fermentation mg/L

2.3.2 对各类糖苷态香气物质含量的影响

将‘北冰红’冰酒中鉴定到的结合态组分依据其定性命名归为9 类，如表3所示，在戊糖基-葡萄糖苷中，结合态单萜二醇是相对含量较高的一类物质，在Red Fruit酵母和Zymaf l ore ST酵母的发酵过程中，其含量均呈逐渐下降趋势，这可能是导致这类戊糖基-葡萄糖苷总量下降的主要原因（图1）。而其他3 类戊糖基-葡萄糖苷物质，在Red Fruit酵母发酵起始（0 d）和发酵结束时（42 d）均没有明显差异，而Zymaflore ST酵母发酵时，这3 类物质含量均随着发酵进程而下降（表3）。

‘北冰红’冰酒中鉴定到5 类己糖基-葡萄糖苷香气物质，1-己醇-鼠李糖基-葡萄糖苷含量相对较高，其在Red Fruit酵母发酵过程中含量有所增加，而在Zymaflore ST酵母发酵过程中含量几乎没有改变；而3-己烯-1-醇-己糖基-葡萄糖苷在2 种酵母发酵过程中，均表现为下降趋势。其他3 类随Red Fruit酵母发酵，或增加或无明显变化，但在Zymaf l ore ST酵母发酵起始与结束的酒样中，含量变化很小（表3）。上述结果表明，2 种酵母发酵对不同的结合态组分的影响存在差异。

2.4 ‘威代尔’冰酒发酵过程中2 种酵母对糖苷态香气物质释放的影响

2.4.1 对不同糖苷类型的香气物质含量的影响

表4 ‘威代尔’冰酒发酵过程中各类糖苷态香气物质质量浓度的变化Table 4 Variation in various aroma glycosides combounds during fermentation of ‘Vidal’ ice wine mg/L

图2 酵母Red Fruit和Zyma flore ST发酵的‘威代尔’冰酒过程中不同糖苷类型香气物质的变化（n=4）Fig. 2 Variation in various aroma glycosides compounds during fermentation of ‘Vidal’ ice wine by Red Fruit or Zyma flore ST (n = 4)

将‘威代尔’冰酒中糖苷结合态香气物质归为3 大类糖苷，分别为葡萄糖苷、戊糖基-葡萄糖苷和己糖基-葡萄糖苷，如图2所示，Zymaflore ST酵母发酵的‘威代尔’冰酒中，这3 大类结合态香气物质的含量均呈显著下降趋势。相比之下，Red Fruit酵母的发酵作用下，结合态香气物质的含量并无明显变化（己糖基-葡萄糖苷类除外），甚至呈现增加的趋势，在目前实验条件下，无法解释增加的原因，推测可能与三糖苷化合物的水解有关。以上结果说明，Zymaf l ore ST酵母发酵较利于‘威代尔’葡萄酒中糖苷态香气前体物的释放，在‘威代尔’基质中，Zymaflore ST酵母中水解不同类型糖苷态物质的酶活性均比较高。而Red Fruit酵母对‘威代尔’葡萄汁中结合态香气物质的水解释放作用较小，相应的水解酶活性较低。而Red Fruit酵母并不适合‘威代尔’冰酒的酿造。

2.4.2 对各类糖苷态香气物质含量的影响

如表4所示，将‘威代尔’冰酒中鉴定得到的结合态香气物质依据本研究的定性命名归为17 类，但在Zymaflore ST酵母发酵的冰酒中，1-己醇-戊糖基-葡萄糖苷和香叶酸-鼠李糖基-葡萄糖苷不能被有效地定量，可能与该发酵罐中这2 类物质的含量较低有关。随Zymaflore ST酵母的发酵，除含量较低的3-甲基-1-丁醇-戊糖基-葡萄糖苷没有明显变化之外，其他14 类结合态物质的含量均呈现下降的趋势。相反，在Red Fruit酵母发酵‘威代尔’的过程中，与起始阶段相比，发酵结束时大多数结合态香气物质含量略有升高或几乎不变。这些结果进一步说明，采用Zymaf l ore ST酵母发酵，能够使‘威代尔’葡萄醪中的各种糖苷态香气物质转化为具有挥发性的游离态香气。

2.5 ‘北冰红’冰酒过滤和瓶储1 年后糖苷态香气物质含量的变化

如表5所示，在葡萄酒发酵结束后进行过滤处理，经过瓶储1 年后，所有结合态香气物质含量均下降，水解率在19.1%～54.5%之间，最高的是单萜醇-鼠李糖苷-葡萄糖苷，结果表明瓶储过程中糖苷态香气前体物发生了较明显的水解，该水解反应主要是酸催化的[28]，且这一过程对底物没有选择性。这也说明冰酒经过1 年的瓶储会有更多的结合态香气前体物释放出来。

表5 ‘北冰红’冰酒（Red Fruit酵母）瓶储1 年糖苷态香气物质的变化（n=8）Table 5 Variation in glycosidically bound aroma compounds of‘Beibinghong’ ice wine after aging for one year (n= 8)

注：同行不同字母表示差异显著（P＜0.05）。

3 讨论与结论

糖苷结合态香气前体物没有挥发性，需要经过水解释放挥发性苷元，水解可通过酶催化或酸催化进行[8]，通过糖苷酶释放苷元的过程可以是一步反应，也可以是一系列连续反应，简单的葡萄糖苷可以通过β-葡萄糖苷酶裂解（一步反应），然而结合了一个非葡萄糖的双糖，则需要特定的外切酶水解糖苷键，如α-鼠李糖苷酶等，接着β-葡萄糖苷键再水解释放出挥发性苷元[8]。酵母在发酵过程中具有糖苷酶活性[20]，不同菌株在发酵条件下的酶相对活性和特异性底物会有所不同[29]，本研究也发现，无论是对‘北冰红’还是‘威代尔’，用Red Fruit酵母发酵对糖苷态香气物质的影响都明显不同于用Zymaflore ST酵母。Chassagne等[30]发现在‘霞多丽’葡萄酒的发酵过程中，不同酵母菌株对糖苷键的水解效果在17%～57%之间变化。

除酵母自身水解酶种类和活性存在差异之外，发酵基质对酶的活性也会产生影响，本研究发现Zymaf l ore ST酵母发酵‘威代尔’冰酒时，糖苷态香气物质有较明显的水解作用，但发酵‘北冰红’冰酒时则没有这种效果。Zinnai等[31]发现一些葡萄酒成分，特别是乙醇对β-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用。同时，较低的pH值、高葡萄糖浓度也会使酵母中糖苷酶的稳定性丧失，导致酶活性的降低[32]。因此在酿酒过程中，对于不同葡萄品种，酿酒师可以通过选用不同的酵母菌株，更好地发掘葡萄酒的香气潜力，充分体现出葡萄酒的风格。

在葡萄酒陈酿期间，糖苷则经历缓慢的酸水解，已有很多研究证据表明，酸水解对糖基基团没有选择性，在低pH值和高温下会发生得更快[3]，这解释了本研究结果，瓶储1 年的葡萄酒中，几乎所有的糖苷态香气物质含量都下降。

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS探究2 个葡萄品种分别在2 种酵母发酵下糖苷态香气物质的变化，研究认为，酵母Red Fruit和Zymaflore ST对发酵过程中‘北冰红’糖苷态香气释放影响较为有限，糖苷态香气释放可能主要在陈酿阶段，相对而言，酵母Zymaf l ore ST发酵较有利于‘威代尔’糖苷态香气的释放。该结果为冰酒的酿造和陈酿工艺设计提供了参考。