水产品中创伤弧菌ddPCR 定量方法的建立

马 丹，魏咏新，李 丹，魏海燕，徐蕾蕊，汪 琦，付溥博，张西萌，曾 静*

（北京海关技术中心，北京 100026）

创伤弧菌是普遍生存在海洋中的一种细菌，若生食受该菌污染的海产品（特别是牡蛎），或皮肤伤口接触存在创伤弧菌的贝类或海水，可在48 h内出现感染性休克、皮肤肌肉坏死、脓毒血症，进而引起多脏器功能衰竭，其死亡率高达50%[1-3]。当前评价水产品安全性的指标仍主要依赖大肠菌群等卫生指标，而这并不能反映创伤弧菌的污染程度。尽管现有法规并没有对贝类等水产中的创伤弧菌数量作出明确的规定，美国食品药品监督管理局却支持对捕获的贝类产品进行处理，以减少或去除创伤弧菌，因此，定量方法对于准确而有效地评估水产脱菌处理措施的有效性十分必要，也有助于相关部门对水产安全性的监管和风险评估。

目前创伤弧菌的定量检测仍以传统培养法为主，如平板计数和MPN法[4-5]，需要经过过夜培养、选择性平板分离、生化鉴定、血清学实验等复杂的过程，不仅耗时费力，而且样品中潜在的其他杂菌有可能会因过度增殖而给目标菌鉴定造成干扰。此外，水产品中的创伤弧菌经常以“活的不可培养状态”存在[6]，传统培养法无法有效检测到这部分细菌[7]，从而影响检测结果的准确性。近年来，以实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）为代表的分子生物学技术也逐渐被广泛应用到创伤弧菌的定量检测中去[8]。相比较于传统培养法，real-time PCR快速、简便、灵敏、特异，然而，该方法仍属于相对定量检测，带有准确量值的标准品往往难以获得，而且样品中核酸扩增的抑制成分、实验环境和操作者的技能等都会直接影响real-time PCR扩增效率和标准曲线的质量，从而干扰检测的准确性[9-10]。

新兴的微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）被认为是第3代核酸扩增技术，通过把稀释到一定浓度的DNA分子分布到10 000～20 000 个微滴中，使大部分微滴中DNA分子数量为1或0，然后通过PCR扩增和阳性信号的累积读取阳性反应单元数，再根据泊松分布计算出样本中的DNA分子数，从而实现对DNA分子的绝对定量[11-16]。目前该技术用于微生物的定量分析尚处于起步阶段，相关的研究如临床样本类免疫缺陷病毒、恶性胸膜瘤、乙型肝炎病毒、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、沙眼衣原体、产志贺毒素的大肠埃希氏菌，以及导致马铃薯减产的植物病原菌等[17-23]，鲜见创伤弧菌定量检测的相关报道，且已有研究鲜有涉及水产等食品。由于食品基质多富含蛋白、脂肪、果胶等核酸扩增抑制成分，背景菌构成复杂且浓度较高，因此，ddPCR对食品中创伤弧菌定量分析的有效性和实用性尚未可知。本研究旨在建立适用于水产品中创伤弧菌的ddPCR精准定量检测技术，为保障食品安全、开展风险评估等研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本研究共使用107 株菌（表1）：创伤弧菌标准菌株1 株、自分离株20 株；其他弧菌标准菌株或自分离株66 株；其他食源性致病菌20 株。

表1 实验菌株Table 1 List of experimental strains used in this study

培养基 北京陆桥技术股份有限公司；DNA提取试剂盒（货号：DP302） 天根生化科技有限公司；ddPCR Supermix for Probes（no dUTP） 美国伯乐公司；2×Taqman Universal PCR mastermix 美国ABI公司。

1.2 仪器与设备

离心机 德国Eppendorf公司；Fr-1iocell恒温培养箱 德国MMM公司；QX200微滴式数字PCR系统美国伯乐公司；7900HT Fast实时荧光定量PCR仪、Veriti 96 well Thermal cycler PCR仪 美国ABI公司；nanodrop 2000超微量分光光度计 美国赛默飞公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的培养

弧菌采用3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂培养基进行活化，37 ℃培养24 h。挑取纯培养后的单菌落到10 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水（alkaline peptone water，APW）中，37 ℃、160 r/min摇床培养18 h，以备梯度稀释用于检测。其他食源性致病菌采用营养琼脂，37 ℃培养24 h。挑取纯培养后的单菌落到10 mL营养肉汤中，37 ℃、160 r/min摇床培养18 h，以备梯度稀释用于检测。

1.3.2 引物探针的设计与筛选

为实现对创伤弧菌的特异性检测和绝对定量分析，分别选取创伤弧菌具有种属特异性且高度保守的单拷贝脂蛋白D基因（nplD，GenBank no. AY187681.1）、RNA聚合酶亚单位σ因子S基因（rpoS，GenBank no.AY187681.1）、毒力相关基因E（vcgE，GenBank no.AY626581.1）和金属蛋白酶基因（met，GenBank no.U50548.1）作为靶序列，通过NCBI在线工具进行序列分析和比对，利用Prime Express软件V3.0（ABI, Foster City, CA, USA）设计出4 对引物和探针组合，序列见表2。探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ。引物/探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。分别利用real-time PCR和ddPCR对创伤弧菌（ATCC 27562）基因组DNA进行检测，比较4 组引物探针的荧光信号，并利用表2菌株验证所筛选引物探针的特异性。

表2 ddPCR引物/探针序列Table 2 Sequences of ddPCR primers and probes

1.3.3 基因组DNA提取与超微量分光光度计测定

利用含3%氯化钠的APW对创伤弧菌（ATCC 27562）的过夜培养菌悬液进行10 倍梯度稀释。采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取各稀释度菌液DNA，提取步骤按照试剂盒说明书进行，最终将核酸溶解在50 μL TE缓冲液中。对提取的核酸用超微量分光光度计进行浓度和纯度的测定，确保提取核酸的A260nm/A280nm在1.8～2.0之间，并按下式计算提取创伤弧菌基因组DNA浓度：

式中：m为超微量分光光度计测得的核酸质量浓度/（ng/μL）；n为细菌基因组的长度/bp；根据NCBI上已经发布的创伤弧菌基因组的测序数据，其平均长度为4.97×106bp；1.096为在由核酸质量浓度换算为拷贝数时的常数。

1.3.4 real-time PCR检测

20 μL的real-time PCR体系包括：2×Taqman Universal PCR mastermix 10 μL，10 μmol/L的上游、下游引物、探针各1 μL，待测DNA模板2 μL。于7900HT Fast实时荧光定量PCR仪上进行扩增，50 ℃酶激活2 min，95 ℃预变性10 min，进而95 ℃变性15 s、60 ℃退火及延伸1 min，40 个循环。反应完成后利用SDS3.2软件进行分析。以10 倍梯度稀释纯菌液中提取的DNA作为标准品，根据1.3.3节基因组DNA提取与超微量分光光度计测定中公式计算出的标准品浓度为横坐标，以对应Ct值为纵坐标，绘制real-time PCR标准曲线，根据回归方程和real-time PCR检测Ct值计算未知样品的靶基因拷贝数。

1.3.5 ddPCR检测

20 μL的ddPCR体系包括10 μL ddPCRTMSuperMix for Probes，上、下游引物各1.5 μL（终浓度750 nmol/L），探针0.5 μL（终浓度250 nmol/L），DNA模板（100～60 ng/μL）2 μL。将20 µL反应预混液和70 μL微滴生成油分装至微滴生成卡的对应孔位中，置于微滴生成仪中进行微滴生成。将生成的微滴全部转入96 孔反应板，于QX200微滴式数字PCR仪中进行扩增。PCR条件：95 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火及延伸1 min，45 个循环；98 ℃固化微滴10 min；4 ℃反应结束。将扩增后的96 孔板置于微滴读取仪中，利用QuantaSoft软件进行结果读取和分析。以阴性微滴簇荧光幅度的最高点为界设定阈值线。

1.3.6 平板计数

对10 倍梯度稀释的创伤弧菌（ATCC 27562）纯菌液，分别吸取1 mL于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。及时将15～20 mL冷却至46 ℃的T1N1琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，36 ℃倒置培养（24±2）h。选取菌落数在30～300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数，每个稀释度菌落数应取2 个平板计数结果的平均数。

1.3.7 人工污染样品的检测

选择经传统方法[6]验证无创伤弧菌的牡蛎样品作为添加基质。同时取10-4、10-5、10-6、10-7稀释度创伤弧菌（ATCC 27562）菌液各25 mL分别添加到盛有25 g牡蛎样品的均质袋中，另取1 份25 g牡蛎样品加入含3%氯化钠的APW代替添加菌液作为阴性对照，上述样品用拍击式均质器拍击2 min，制成系列1∶1含有不同浓度创伤弧菌的污染样品。取各样品均质液2 mL分别利用试剂盒法提取细菌基因组DNA，最终将核酸溶解在50 μL TE缓冲液中，进行ddPCR和real-time PCR检测。

1.4 统计学分析

人工污染样本的ddPCR和real-time PCR检测均设置5 个重复，通过t检验比较2 种方法的定值结果，P＜0.05，差异显著。同时将ddPCR和real-time PCR测定结果分别与人工污染样本的理论添加值进行一元线性回归分析，以ddPCR或real-time PCR测定结果作为纵坐标，各稀释度理论添加值为横坐标，绘制线性回归直线，比较ddPCR和real-time PCR的定值准确度。

2 结果与分析

2.1 引物探针的设计与筛选

图1 real-time PCR（A、B）和ddPCR（C、D）对引物探针的筛选和特异性验证Fig. 1 Screening and specificity verification of primers/probes used for real-time PCR (A and B) and ddPCR (C and D)

分别以创伤弧菌单拷贝基因nplD、rpoS、vcgE和met为靶基因设计出4 对引物、探针，同时采用real-time PCR和ddPCR对创伤弧菌（ATCC 27562）基因组DNA进行检测。结果发现4 组引物探针在real-time PCR和ddPCR的检测体系中均能进行有效扩增，且met-F/R/P的荧光信号强度最大，扩增效果最好（图1A、C）。进而利用met-F/R/P引物探针对表1所列菌株DNA进行real-time PCR和ddPCR检测。结果发现real-time PCR仅对创伤弧菌标准菌株（ATCC 27562）和20 株自分离株出现阳性扩增信号，其他食源性致病菌均呈阴性（图1B）；ddPCR对创伤弧菌（ATCC 27562）检测呈阳性，对副溶血性弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌与河流弧菌met基因检测均呈阴性（图1D）。综上可见，met-F/R/P灵敏、特异，且同时满足real-time PCR和ddPCR的扩增条件，将其用于后续的定量分析实验。

2.2 创伤弧菌纯菌液中ddPCR与real-time PCR、平板计数、超微量分光光度计测定结果的比较

图2 梯度稀释的创伤弧菌纯菌液ddPCR扩增微滴分布图（A）与real-time PCR扩增图谱（B）Fig. 2 Ampli fication curves of gradient dilutions of V. vulni ficus by ddPCR (A) and real-time PCR (B)

创伤弧菌（ATCC 27562）的过夜培养菌悬液经平板计数测得其浓度为1.3×109CFU/mL，其对数值为9.11。经超微量分光光度计测定，其原始菌液DNA质量浓度为413.6 ng/μL，代入1.3.3节公式算得基因组DNA浓度为7.6×107拷贝数/μL，按照1 拷贝基因组对应1 个CFU菌落，则原始菌液浓度为3.8×109CFU/mL，其对数值为9.57。取各稀释度菌液DNA同时进行ddPCR和real-time PCR检测，结果发现ddPCR可检测到10-8稀释度（图2A），而real-time PCR仅检测到10-7（图2B）。ddPCR在10-2稀释度达到检测上限，阳性微滴的比率达100%，ddPCR的定值动态范围为10-3～10-7稀释度（图2A，表3），由不同稀释度菌液计算出原菌液中创伤弧菌met基因含量的对数平均值为9.46，同核酸蛋白分析仪及平板计数法测得值均非常接近，分别相差了0.11、0.35 个对数值（图3）。

表3 梯度稀释的创伤弧菌纯菌液ddPCR定量检测结果Table 3 Quantitative results of ddPCR for gradient dilutions of V. vulnificus

图3 创伤弧菌纯菌液中基因组浓度定值结果比较Fig. 3 Comparison of results of determination of genomic concentration in pure culture of V. vulnificus

2.3 人工污染样品中ddPCR与real-time PCR定量检测结果的比较

图4 人工污染牡蛎样品real-time PCR扩增曲线图（A）与ddPCR扩增微滴分布图（B）Fig. 4 Real-time PCR amplification curves (A) and ddPCR amplification droplet distribution (B) of artificially contaminated oyster samples

表4 ddPCR与real-time PCR对人工污染牡蛎样品中创伤弧菌的定量检测结果Table 4 Quantitative results of V. vulni ficus in arti ficially contaminated oyster samples by ddPCR and real-time PCR

取10-7～10-4稀释度创伤弧菌ATCC 27562纯菌液添加到牡蛎样品中制成人工污染阳性样本。根据添加菌液的平板计数结果，预计污染样品中创伤弧菌含量为9.2×101～9.2×104CFU/g。real-time PCR检测扩增曲线如图4A所示，根据Ct值和得到的标准曲线计算污染样品中创伤弧菌平均含量分别为415 400、29 102、1 954、165 拷贝数/g（表4）。而ddPCR检测结果显示，随着污染水平的下降，阳性微滴数量逐渐减少（图4B），由QuantaSoft软件计算测定的创伤弧菌含量分别为133 200、11 610、1 210、113 拷贝数/g（表4）。经过t检验，real-time PCR和ddPCR的定量结果在10-7菌液污染样本中无显著性差异（P＞0.05），而其余3 个高水平（10-6、10-5、10-4稀释度）污染样本中2 种方法定值结果存在显著性差异（P＜0.05）。经线性回归分析，发现ddPCR的定量结果更接近预计值，约为平板计数结果的1.4 倍，而real-time PCR定量结果则为平板计数的4.5 倍（图5），说明ddPCR的准确度优于real-time PCR。

图5 real-time PCR（A）和ddPCR（B）对人工污染牡蛎样品中创伤弧菌含量的测定结果同平板计数预计值间的相关性分析Fig. 5 Correlation analysis between experimental values from real-time PCR (A) and ddPCR (B) and predicted values from plate counting for V. vulnificus in artificially contaminated oyster samples

2.4 ddPCR的检测限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）

在检测动态范围内，测得内外源基因拷贝数的变异系数（coefficient of variation，CV）不高于25%的最低浓度水平，即为LOQ；能被可靠检测到，而不一定定值的最低拷贝数，即为LOD。ddPCR对创伤弧菌（ATCC 27562）10-7和10-8稀释度菌液DNA的检测CV分别为17.01%和79.13%，因此LOD和LOQ分别为61 拷贝数/mL和323 拷贝数/mL（表3）。在人工污染牡蛎样品中，ddPCR在不经增菌培养的条件下能最低能检测到1.13×102拷贝数/g的创伤弧菌（CV为17.02%）。

2.5 ddPCR检测重复性分析

针对创伤弧菌纯菌液（表3）和人工污染牡蛎样品的检测结果（表4）显示，在整个定量检测动态范围内ddPCR测定结果CV普遍小于20%，满足国际上对核酸定量方法的验证要求，而且在对人工污染牡蛎样品的检测中，ddPCR定量结果的CV普遍小于real-time PCR，说明ddPCR具有更好的重复性。

3 结论与讨论

本研究建立的水产品中创伤弧菌的ddPCR精准定量检测技术，无需进行增菌培养及后续的特征性菌落鉴定、生化分析等步骤，大幅缩短检测时间，简化操作流程，展现出了广阔的应用前景。

首先，选取创伤弧菌4 个单拷贝基因分别设计1 组引物和探针，发现met-F/R/P无论是在real-time PCR还是ddPCR中均表现出较强的荧光扩增信号，且与其他常见弧菌和食源性致病菌均无非特异性反应，呈现出良好的包容性和排他性。利用该ddPCR技术对创伤弧菌纯菌液的LOD和LOQ分别为61 拷贝数/mL和323 拷贝数/mL（表3）；对人工污染牡蛎样品，在不经增菌培养的条件下ddPCR的LOQ可达113 拷贝数/g，满足国际微生物标准委员会以及GB 29921—2013《食品中致病菌限量》对水产品中弧菌的最高安全限量要求（1 000 CFU/g）[24]。

在梯度稀释的创伤弧菌纯菌液中，ddPCR和real-time PCR的检测范围分别达10-3～10-8及10-2～10-7，可见ddPCR对创伤弧菌的检测灵敏度高于real-time PCR，但在当菌液浓度高至一定程度（10-2稀释度），ddPCR的阳性扩增微滴达到100%时，即超出了ddPCR的定值范围。因此，ddPCR更适于低浓度样品的检测，而real-time PCR则不受限于靶基因的高浓度，这与已有研究结论一致[25]。鉴于水产品中创伤弧菌的感染量往往较低，因此并不影响ddPCR技术在水产品中的应用。在人工感染的牡蛎样品中，ddPCR的定量结果更接近理论添加值，相关性分析显示ddPCR检测结果为平板计数结果的1.4 倍，而real-time PCR则为平板计数的4.5 倍（图5）。究其原因，一方面real-time PCR作为一种相对定量检测技术，其结果很大程度上依赖于标准曲线的绘制，在本研究中，标准样品是提取自创伤弧菌纯菌液的基因组DNA，与提取自牡蛎样品的待测核酸必然存在扩增效率差异，且标准品DNA的梯度稀释、紫外分光光度法对DNA浓度的测定，都会导致检测误差的产生。而ddPCR是直接对提取自牡蛎样品中的DNA进行定量分析，且是终点检测，对样品中抑制剂的耐受度更高[26-29]，因此呈现出更高的定量准确性和良好的检测重复性（测定结果CV普遍小于20%），特别是在低污染样品中这种优势更加明显。

本研究建立的ddPCR检测方法能快速准确、特异、灵敏地定量检测创伤弧菌，特定样品中细菌真实数量的定量检测在风险评估中的作用至关重要[30]，对突发公共卫生事件应急检测、控制疫情扩散、提高病原菌检出率等均有重要意义。