黔产忍冬叶薄层鉴别方法研究

龙立慧，黄兴龙，李新建，马子力，张丽艳*，罗 君

(1.贵州中医药大学，贵州 贵阳550025；2.贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 550001)

忍冬最早出现于《名医别录》中，被列为上品[1]，《新修本草》中有关于忍冬叶、藤描述：“其嫩茎有毛，叶似胡豆亦上下有毛，花白蕊紫。”《本草经集注》中以“十二月采，阴干”描述忍冬，而忍冬花的花期在春夏季，因此可以推理出当时用的是叶或藤。在宋代时期之前多以忍冬的叶、藤入药。而在宋代以后，才开始使用忍冬花，如李时珍在《本草纲目》中认为忍冬茎叶与花功效相同，说明此时忍冬的花叶一同入药[2]。现有研究多集中在花和藤的化学成分、药理作用上，对于其他部位的研究较少。有研究报道，忍冬叶的药理活性与金银花相当或优于金银花，其功效除受绿原酸含量的影响外，还与其他活性成分有关[3]。

忍冬叶为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥叶[4]，收载于2002年版《山东省中药材标准》，与《中国药典》(2015年版)中金银花是同科、同属、同种，不同的用药部位，忍冬花和忍冬藤均被载入中国药典，而忍冬叶目前尚未收载入《中国药典》[5]。《山东省中药材标准》对忍冬叶中绿原酸的TLC鉴别、含量测定进行了研究，而木犀草苷的研究尚未收载。此外，贵州省地区(龙里、安顺、兴义、毕节、六盘水等地)忍冬叶的产量、使用量较大，但并未被纳入《贵州省中药材质量标准》之中。

基于此，本研究建立贵州省不同产地忍冬叶药材的完整薄层定性鉴别方法，一方面可避免忍冬资源的浪费，为最大程度地合理利用忍冬资源提供科学依据。另一方面可为贵州省中药材、民族药材的新增药材奠定研究基础。

1 材料与仪器

1.1 药材

样品于2017年采自贵州省各区县，阴干。药材经贵州中医药大学植物栽培教研室魏升华教授鉴定为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThund.的干燥叶。药材信息见表1。

表1 药材来源

1.2 仪器

HH-6电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；ZF7紫外分析仪(巩义市予华仪器有限责任公司)；XS105DU电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。

1.3 试药

乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酮、甲酸、水(蒸馏水)、甲醇、乙醇、均为分析纯；硅胶G板(批号：20151012、20180404；厂家：青岛海洋化工厂、烟台江友硅胶开发有限公司)；绿原酸对照品(批号：110753-201716)、木犀草苷对照品(批号：1172-201609)均购于中国食品药品检定研究院。

2 实验方法

2.1 对照品及供试品溶液制备

2.1.1 绿原酸对照品溶液 取绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成约1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液1。

2.1.2 木犀草苷对照品溶液 取木犀草苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成约40 μg/mL的溶液，作为对照品溶液2。

2.1.3 供试品溶液 取干燥至恒重的忍冬叶药材粉末0.5 g，精密称定，用50 mL甲醇溶剂进行超声(功率：250 W，频率为40 kHz)提取45 min后滤过，提取液水浴蒸干，残渣加入5 mL甲醇溶解作为供试品溶液。

2.2 展开体系

绿原酸展开剂为乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶水(7∶3∶1∶1.2)；木犀草苷展开剂为乙酸丁酯∶甲酸∶水(7∶2.5∶2.5)取上层溶液，均采用1%三氯化铁为显色剂。

2.3 耐用性考察

2.3.1 薄层板考察 参照薄层色谱法2015年版中国药典四部通则0502试验。取供试品溶液10 μL、对照品溶液5 μL，依次点于硅胶G板上，采用“2.2”项下展开体系，分别对自制、青岛、烟台硅胶G板进行考察。结果显示，忍冬叶绿原酸与木犀草苷在不同硅胶G板上所呈现的色谱行为基本一致，表明该方法对不同厂家生产的硅胶G板均具有良好的适应性。如图1、图2所示。

注：1.绿原酸；2-5.样品

注：1.木犀草苷；2-5.样品

2.3.2 温度考察 参照薄层色谱法2015年版中国药典四部通则0502试验。取供试品溶液10 μL、对照品溶液5 μL，依次点于硅胶G板上，采用“2.2”项下展开体系，分别在40 ℃、5 ℃下对该方法进行考察。经考察，在高温和低温状态下均可达到较好的分离效果，表明温度对该薄层色谱的影响较小。如图3、图4所示。

注：1.绿原酸；2-5.样品

注：1.木犀草苷；2-5.样品

2.3.3 相对湿度考察 参照薄层色谱法2015年版中国药典四部通则0502试验。取供试品溶液10 μL、对照品溶液5 μL，依次点于硅胶G板上，采用“2.2”项下展开体系，分别在相对湿度86%、54%、24%环境下对该方法进行考察。结果在不同相对湿度下，所呈现的色谱行为基本一致，表明湿度对该薄层色谱的影响较小。如图5、图6所示。

注：1.绿原酸；2-5.样品

注：1.木犀草苷；2-5.样品

3 实验结果

3.1 绿原酸薄层鉴别

参照薄层色谱法2015年版中国药典四部通则0502试验。吸取上述供试品溶液10 μL，对照品溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶水(7∶3∶1∶1.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。薄层色谱图中，供试品与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。如图7所示。

注：1.绿原酸对照品；2-16.样品

3.2 木犀草苷薄层鉴别

参照薄层色谱法2015年版中国药典四部通则0502试验。吸取上述供试品溶液10 μL，对照品溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸丁酯∶甲酸∶水(7∶2.5∶2.5)上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。在薄层色谱图中，供试品与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。如图8所示。

注：1.木犀草苷；2-16.样品

4 讨论

薄层色谱鉴别是中药质量控制常用的定性鉴别方法，具有快速、直观、信息量大的特点，能够辨别药材真伪及一定程度上反映药材的质量。本研究前期对超声、回流提取两种方法进行了考察，结果超声与回流处理的薄层色谱斑点相差不大，供试品与对照品在相应的位置上有相同颜色的斑点，且分离效果较好，但超声处理操作简便、快捷，因此，最终选择超声为忍冬叶的提取方法。样品经超声处理后，可同时用于绿原酸、木犀草苷的薄层鉴别，同时也是本研究的优势之一，且该提取方法操作简单，可作为忍冬叶薄层鉴别的提取方法。通过考察绿原酸、木犀草苷的不同展开系统，最后确定了绿原酸以乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶水(7∶3∶1∶1.2)为展开剂，1%三氯化铁溶液为显色剂；木犀草苷以乙酸丁酯∶甲酸∶水(7∶2.5∶2.5)上层溶液为展开剂，1%三氯化铁溶液为显色剂。二者薄层色谱图中供试品与对照品在相应的位置均显示相同颜色的斑点，斑点分离度较好，且清晰、圆整、明显。本研究建立的忍冬叶薄层鉴别方法操作简便、专属性强、重现性好、结果可靠，进一步完善了忍冬叶药材的定性鉴别，为黔产忍冬叶的质量标准建立提供了实验基础，丰富了贵州省中药材、民族药材的应用种类。