肾宝提取物对雄性应激大鼠性行为的影响

耿 炤，周青罡，周美娟，于小娟，余日跃

(1.江西汇仁药业股份有限公司，江西 南昌 330052；2.江西中医药大学，江西 南昌 330004)

肾宝糖浆(合剂)是温补肾阳的主要中成药品种之一，由22味中药组方经提取制剂成型，上市已经30余年，目前开发的同方制剂有片剂、颗粒剂、胶囊剂等。肾宝糖浆收载于《中国药典》，其温补肾阳，固精益气，用于肾阳亏虚、精气不足所致的阳痿遗精、腰腿酸痛、精神不振、夜尿频多、畏寒怕冷、月经过多、白带清稀。研究[1-3]表明，肾宝处方可能存在着淫羊藿苷类黄酮为代表性活性物质，作用于泌尿、生殖系统，具有促进性功能等方面的作用。为了进一步探讨肾宝糖浆不同工艺及其主要功效，我们在以往研究采用“去势模型”和“肾损害致阳虚模型”基础上选择了“重复应激致动物性行为低下动物模型”结合交配试验、性激素和性器官指数，该模型与人的临床患病机制接近，且可操作性强，现报道如下。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级SD系健康大鼠400只，雌雄各半，平均体质量(240±20)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物生产许可证编号：SYXK(湘)2011-0003。

1.2 供试品与试剂

SJ1、SJ2、SJ3、SJ4、SJ5和白酒，其中SJ1为肾宝糖浆组；SJ2为肾宝糖浆减量组；SJ3为肾宝糖浆浸膏直接加白酒勾兑组；SJ4为肾宝糖浆药材白酒直接浸泡组；SJ5为肾宝糖浆药材用白酒超声提取组，各组均为等剂量溶液，由江西汇仁药业有限公司技术中心提供。

睾酮试剂盒、促卵泡刺激素试剂盒、促黄体生成素试剂盒，由罗氏诊断产品(上海)有限公司提供。

1.3 仪器设备

BL-420/820生物机能试验系统(成都泰盟科技有限公司)；安全监控录像系统(泰克威视)；水迷宫(上海欣软信息科技有限公司)；湘雪节能取暖器(湘雪取暖器厂)；罗氏全自动电化学发光免疫分析系统。

2 方法

2.1 去势雌性大鼠的制备

取雌性大鼠200只，经4%水合氯醛腹腔麻醉(1 mL/100 g)后，作腹部正中切口，在无菌条件下进入腹腔，完整摘除双侧卵巢。术后连续肌肉注射青霉素抗感染3日，5万U/只，每日1次。术后所有动物在同一条件(室温19～24 ℃，相对湿度40%左右)用普通饲料饲养，自由饮水。

2.2 发情雌鼠的准备

雌鼠去势2周后用于交配实验。实验前48 h皮下注射20 μg苯甲酸雌二醇，实验前4 h皮下注射500 μg黄体酮催情，以备交配实验使用。

2.3 雄性大鼠性能力筛选

将雄性大鼠单独置于鼠透明塑料笼具内，保持安静，使用安全监控录像系统进行录像，将光线调暗至能够观察和录像即可。10 min后将1只发情雌性大鼠轻放入雄鼠笼内，随即摄下90 min内大鼠的交配活动。将无交配记录的雄性大鼠剔除。

2.4 肾虚雄性大鼠的制备

将具有性能力的168只雄性大鼠随机均分为12组，分别为模型组、白酒组、高低剂量SJ1组、高低剂量SJ2组、高低剂量SJ3组、高低剂量SJ4组、高低剂量SJ5组。各组大鼠均采用慢性不可预知刺激，使大鼠长期处于应激状态，制备应激所致大鼠肾虚模型。造模组按以下方法进行造模：①冰水游泳：将大鼠放入冷水桶中，15 min/次；②禁水：从早晨8∶00开始断水到次日早晨8∶00，共24 h；③禁食：从早晨8∶00开始断食到次日早晨8∶00，共24 h；④热应激：取暖器调到约40 ℃恒定，将大鼠放入取暖器中，15 min后取出；⑤明暗颠倒：从早晨8∶00开始将大鼠放入自制的暗箱中，晚上8∶00取出，后将大鼠放置在单独的实验室中，并通宵照明，至第2天早晨8∶00结束；⑥夹尾：用大鼠夹尾夹夹在距尾根约1 cm处，每次持续1 min，一共3次；⑦潮湿垫料：使大鼠置于潮湿环境中持续24 h(潮湿垫料按每100 g垫料加水200 mL)；⑧电击每次5min，一共3次；⑨束缚每次20 min。每日随机安排给予1种刺激交替刺激大鼠21天，同一种刺激出现不超过3次，并且不连续出现，使其不能预知给予的刺激。另取12只大鼠作为正常对照组，不施加任何干扰因素。

表1 大鼠应激方法及随机排序结果

2.5 给药方法

雄性大鼠应激21天后开始给药，受试药物组大鼠每日灌胃给药1次，分别灌胃高剂量白酒，高(G)低(L)剂量SJ1、高低剂量SJ2、高低剂量SJ3、高低剂量SJ4、高低剂量SJ5、空白组和模型组大鼠每日灌胃给予等容积蒸馏水，灌胃量为6 mL/kg，连续给药4周。

2.6 性行为学观察

给药第4周后，同方法3观察大鼠交配情况，摄下40 min内大鼠的交配行为。回放录像记录以下参数：①骑跨潜伏期：雌雄鼠同笼至雄鼠第1次骑跨所需的时间；②骑跨总次数：雌雄鼠同笼后雄鼠出现骑跨行为的总次数；③骑跨活动鼠数：有骑跨行为的雄性鼠数；④射精活动鼠数：有射精行为的雄性鼠数；⑤射精潜伏期；⑥射精间隔期。雄鼠的每一次骑跨并不一定伴有插入。以上参数用以评价大鼠性欲、性唤醒的启动速度、勃起功能的高低。

2.7 动物处理

性行为观察结束次日，称取大鼠体质量，用3%的异戊巴比妥麻醉大鼠，行腹主动脉取血，并立即离心取血清在于-80 ℃冰箱备用；再取出睾丸、附睾、前列腺以及精囊，称量并记录，计算性器官的相应指数。

2.8 性激素的检测

取1 mL血清，于全自动电化学发光免疫分析系统进行睾酮、促卵泡刺激素、黄体生成素的检测。

2.9 数据处理

统计与绘图软件为Graphpad Prism 5.0，进行方差检验。所有交配实验数据均按给药前后的差值进行统计。

3 结果

3.1 SJ对应激大鼠性行为的影响

所有雄性大鼠在应激状态下跨骑潜伏期均有所缩短，但与模型组比较，各给药组均无显著差异性。提示应激时雄性对雌性大鼠仍有性兴趣，SJ对应激大鼠的跨骑潜伏期无明显影响，见图1。应激雄性大鼠跨骑次数有一定的下降趋势，SJ有一定的增加跨骑次数的趋势，但与模型组比较，各组均无显著性差异，见图2。

图1 SJ对应激大鼠跨骑潜伏期的影响

图2 SJ对应激大鼠跨骑总次数的影响

雄性大鼠在应激状态下，射精潜伏期无明显变化，但SJ2～SJ5对射精潜伏期均有所缩短，与模型组比较，SJ5L组有非常显著的缩短，提示SJ5L对提高性行为有一定帮助，见图3。应激可一定程度上延长雄性大鼠射精的间隔时间，与模型组比较，SJ2G、SJ3L、SJ3G、SJ4L、SJ5L均有显著缩短射精间隔时间的作用，尤其是SJ5L对缩短射精间隔有非常显著的作用。提示SJ2～SJ5具有促进性功能快速恢复的能力，且SJ5较SJ2有更显著的促进作用。见图4。

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与白酒组较，^P<0.05，^^P<0.01。

图3 SJ对应激大鼠射精潜伏期的影响

图4 SJ对应激大鼠射精间隔时间的影响

3.2 SJ对应激大鼠性激素的影响

对FSH、LH的检测表明，其血清含量在较低的水平线波动，无显著的生理学意义。应激对大鼠睾酮的影响不明显，SJ对睾酮含量影响也不明显，仅SJ1G有显著提高睾酮含量的作用。见表2、图5。

组别睾酮(ng/mL)FSH(IU/L)LH(IU/L)对照组2.18±1.630.05±0.020.04±0.02模型组2.43±2.270.05±0.020.05±0.02白酒药2.77±1.810.05±0.020.04±0.02SJ1L2.59±1.010.05±0.020.05±0.03SJ1G6.67±3.680.05±0.020.06±0.02SJ2L2.36±1.410.04±0.020.05±0.03SJ2G2.73±2.980.09±0.070.09±0.15SJ3L4.41±2.720.05±0.020.06±0.02SJ3G2.57±1.500.04±0.020.04±0.02SJ4L1.62±1.870.07±0.020.08±0.03SJ4G1.69±1.680.04±0.020.05±0.02SJ5L1.93±1.270.08±0.070.06±0.10SJ5G4.32±3.250.04±0.030.05±0.02

图5 SJ对应激大鼠血清睾酮含量的影响

3.3 SJ对应激大鼠性器官指数的影响

应激对性器官的生长具有一定的抑制作用，尤其是睾丸与精囊腺抑制性更明显。与模型组比较，JS2G、SJ3L、SJ4G、SJ5具有对抗应激所致睾丸的生长抑制作用；白酒组、JS1L、SJ3L、SJ4、SJ5L具有对抗应激所致前列腺抑制作用；JS1L、SJ2L、SJ3L、SJ5具有对抗应激所致精囊腺抑制作用。见表3。

组别睾丸比重前列腺比重精囊比重附睾比重正常组0.69±0.20∗∗0.15±0.060.42±0.10∗0.11±0.02模型组0.49±0.070.11±0.030.34±0.080.09±0.01白酒组0.51±0.100.16±0.04∗∗0.38±0.100.10±0.01SJ1G0.50±0.150.12±0.020.40±0.140.08±0.02SJ1L0.55±0.140.17±0.04∗∗0.48±0.05∗∗0.09±0.01SJ2G0.57±0.05∗0.14±0.040.42±0.120.08±0.00SJ2L0.56±0.190.14±0.060.42±0.10∗0.09±0.01SJ3G0.56±0.140.13±0.050.32±0.130.09±0.02SJ3L0.67±0.11∗∗0.15±0.04∗0.50±0.13∗∗0.10±0.02SJ4G0.66±0.17∗∗0.14±0.02∗0.40±0.110.09±0.01SJ4L0.52±0.180.13±0.05∗0.40±0.140.08±0.02SJ5G0.58±0.10∗0.14±0.050.44±0.12∗0.09±0.01SJ5L0.60±0.15∗0.16±0.05∗∗0.50±0.12∗∗0.10±0.02

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

4 讨论

肾宝最初定位于治疗阳萎、遗精等疾病，早期研究结果表明该药似具有雄性激素样作用，故对性机能减退症(阳萎)有治疗功效，能使小鼠的氧耗量稍增，对能量代谢可能起促进作用[4-7]。本研究结合肾宝的功能主治，明确其动物试验上以性功能指标和肾阳虚指标为核心，其中性功能指标即动物的交配能力、性激素水平、性器官指数、阴茎海绵体cGMP和阴茎勃起潜伏期等；肾阳虚指标主要是抗疲劳、自由基水平及部分性功能指标。采用应激模型较以往的模型更接近临床，应激可能对实验动物性器官的生长具有一定的抑制作用，但对性功能的抑制作用不显著。

本实验重点考察了肾宝处方采用不同提取工艺制成的不同极性提取物对性功能的影响，同时还设计了空白对照和高低剂量组，发现所有提取物均能显著缩短雄性大鼠射精间隔，但不同实验组间具有一定差异。相关结合化学物质基础的同步研究还在进行。本研究为肾宝的处方及其制剂的二次开发提供了一定依据。