高效液相色谱法测定苦荬菜中木犀草苷和菊苣酸的含量

曾文辉，龚千锋，廖宝源

1.江西省药品检查员中心赣南药品检查所，江西 赣州 341000；2.江西中医药大学，江西 南昌 330000；3.赣州市食品药品检验检测中心，江西 赣州 341000

苦荬菜Ixeris chinensis（Thunb.）Nakai 为菊科植物山苦荬、抱茎小苦荬的新鲜或干燥全草，主要分布在浙江、江苏、广西、贵州、福建、湖南、江西、安徽等地，具有清热解毒，消肿排脓，凉血止血，生津止渴等功效。在《湖南省中药材标准（2009 版）》《藏药标准》均有收载苦荬菜，但缺少含量测定项，不足以控制其药材质量。据文献报道［1-3］，苦荬菜主要含有黄酮类、木质素类、萜类，此外还有有机酸类、甾醇类、苯丙素类等。相关药理实验表明，苦荬菜具有抗菌、抗炎保肝、抗肿瘤、降脂、降糖的功效［4-10］。苦荬菜分布广泛，营养成分丰富，化学成分较复杂，生理活性和药理活性较高，具有广阔的开发利用前景［11-14］。但目前缺乏有效的质量控制，对苦荬菜的应用开发具有的一定的限制，因此，本研究在参考相关文献［15-16］基础上，首次建立了高效液相色谱测量苦荬菜中木犀草苷和菊苣酸含量的方法，该方法简单准确，可以为苦荬菜的质量标准研究提供参考。

1 材料与仪器

岛津LC-20AT 型高效液相色谱仪，AUW220D型电子天平（十万分之一，日本岛津公司）；BS224S型电子天平（万分之一，Sartorius）；KQ250DB 型数控超声波清洗器（巩义市予华仪器有限责任公司）；KQ5200 型水浴锅（昆山市超声仪器有限公司）。

木犀草苷对照品（批号：111720-201810，中国食品药品检定研究院），菊苣酸对照品（批号：111752-201703，中国食品药品检定研究院），甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

本实验收集到不同批次的苦荬菜样品共14 批，样品信息见表1，样品经江西中医药大学龚千锋教授鉴定为苦荬菜Ixeris chinensis（Thunb.）Nakai。

表1 不同批次的苦荬菜样品信息

2 方法与结果

2.1 苦荬菜药材供试品溶液

精密称取苦荬菜药材粉末（过5 号筛）0.3 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称重，回流提取30 min，称重补重，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2 对照品溶液制备

精密称取木犀草苷、菊苣酸对照品适量，分别加甲醇制成每1 mL 含木犀草苷0.092 mg、菊苣酸0.043 mg 的溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱：COSMOSIL C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%磷酸溶液（18∶82）为流动相；检测波长：330 nm；体积流量：1.0 mL/min，柱温40 ℃。理论塔板数按木犀草苷计算不低于8 000，菊苣酸不低于6 000。如图1 中A、B 图，苦荬菜药材供试品溶液中木犀草苷、菊苣酸分离度良好。

图1 混合对照品（A）和苦荬菜供试品（B）色谱图

2.4 线性关系试验

分别精密吸取木犀草苷、菊苣酸对照品溶液按按1、3、7、10、15、20 μL 注入液相色谱仪中，按“2.3”项下色谱条件测对照品峰面积，将进样量与峰面积进行回归处理，回归方程为：木犀草苷为：Y=1 574 808.465 5X-38 375.035 7，r=0.999 7（n=6），木犀草苷对照品在0.092～1.84 μg 范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系；菊苣酸为：Y=2 318 633.009 0X-7 358.214 3，r=0.999 9（n=6），菊苣酸对照品在0.043～0.86 μg 范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

分别精密吸取木犀草苷、菊苣酸对照品溶液10 μL，按“2.3”项下色谱条件，重复进样6 次，测定木犀草苷和菊苣酸峰面积值，结果显示木犀草苷RSD 为0.13 %，菊苣酸RSD 为0.32 %。表明仪器的精密性较好。

2.6 稳定性试验

取供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，按“2.3”项下色谱条件，按一定的间隔时间进样，测定供试品溶液中木犀草苷和菊苣酸峰面积值，结果显示在24 h 内木犀草苷的RSD 为0.27 %，菊苣酸的RSD 为1.35 %。表明供试品在24 h 内稳定。

2.7 重复性试验

取已知含量苦荬菜药材约0.3 g，共六份，照“2.1”项下实验方法制成供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，计算药材中木犀草苷和菊苣酸的含量，结果显示，木犀草苷平均含量为7.082 3 mg/g（RSD 为0.62 %）；菊苣酸平均含量为2.522 1 mg/g（RSD 为1.45 %）。表明该方法重现性良好。

2.8 平均加样回收率试验

称取已知含量的样品约0.15 g 六份，精密称定，置具塞锥形瓶中，按100 %加入木犀草苷和菊苣酸对照品适量，按照“2.1”项下实验方法制成供试品溶液，测定溶液中木犀草苷和菊苣酸的含量，计算回收率，结果见表2。

2.9 样品的含量测定

取10 批不同苦荬菜药材，分别照“2.1”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，每份进样3 次，计算木犀草苷和菊苣酸的含量，结果见表3。

表2 木犀草苷和菊苣酸的加样回收率

表3 木犀草苷和菊苣酸含量测定结果（mg/g）

3 讨论

苦荬菜已有相关的研究表明乃是药食两用的药材，对保肝、抗氧化都具有一定的作用。所测成分木犀草苷和菊苣酸分属于黄酮和酚酸类，都具有抗氧化等作用，且预实验中发现含量较高，因而本实验选取此两个成分进行定量分析。在考察不同溶剂的提取以及不同的提取方法时发现70%甲醇为最佳提取溶剂，提取方式选择回流。在流动相的选择上，比较了乙腈-水，乙腈-冰醋酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液，发现乙腈-0.1%磷酸水溶液对色谱峰的分离效果好。

由表3 中数据可知，木犀草苷的含量至少在3 mg/g 以上，对比不同产地的苦荬菜中的菊苣酸含量，整体上低于木犀草苷。在已报道文献中，苦荬菜的含量测定大多数是对木犀草苷进行限量考察［15］；同时，不同产地中，木犀草苷和菊苣酸含量亦有差异，地域差异可能是导致含量异同的主要因素。因此，在临床用药上，为选择药材的来源地提供科学实验数据。