穴位埋线对血管性痴呆大鼠海马COX-2、PGE2表达的影响

胡雪梅，朱正耀，唐中生，朱世杰，范瑞娟，谢高宇

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是脑血管疾病引起的缺血性或出血性损伤而导致的以认知功能障碍等为主要症状的临床综合征[1]。大脑出血性或缺血性损害会导致脑组织的炎症，尤其对海马CA1区影响较为明显，从而影响人的学习记忆能力。研究表明，前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)/环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)信号通路参与多种疾病的炎症反应过程，在脑卒中引发的炎症反应中发挥重要作用，并加重炎症的发生。在正常组织中，COX-2表达较少，炎症发生后COX-2的表达增加，并加重氧化应激反应，催生前列腺素等促炎因子，从而加重炎症反应，COX-2表达后催化花生四烯酸生成PGE2[2-3]。PGE2是关键的促炎因子，在调节炎症中起着核心作用。穴位埋线是一种在中医学和针灸学理论指导下，按照《实验动物穴位图谱》将可吸收性外科缝线置入穴位内，埋在穴位内的可吸收外科缝线可对穴位产生持续性刺激以防治疾病的方法[4]。穴位埋线疗法可活血化瘀，从而减轻炎症，改善VD大鼠学习记忆能力[5]，但其机理尚不明确。基于此，本课题从炎症因子的角度，研究穴位埋线治疗后VD大鼠海马CA1区COX-2以及血清中PEG2的变化及该变化与大鼠学习记忆改善的关系，以此揭示穴位埋线治疗VD可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康雄性SD大鼠80只，体重250～300 g，清洁级，由重庆滕鑫比尔实验动物销售有限公司提供，许可证号：SCXK(渝)2012-0005，实验动物常规饲养1周。

1.2 动物模型的建立

将80只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、VD模型组、VD尼莫地平组、VD穴位埋线组，除假手术组外，其他3组采用改良Pulsinelli’s 4血管阻断法建立VD大鼠模型。采用3%戊巴比妥钠(1 mL/100 g)腹腔麻醉，将麻醉后的大鼠固定，用手术剪将大鼠颈部的毛剪掉，碘伏消毒大鼠颈部皮肤，先行背侧颈正中切口，用电凝针烧灼双侧第1颈椎翼小孔内的椎动脉，造成永久性闭塞。再行腹侧颈正中切口，钝性分离皮下结构，充分暴露颈总动脉，用玻璃分针将双侧颈总动脉与迷走神经剥离，穿线备用。24 h后用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉5 min，5 min后取开动脉夹。间隔1 h后，继续微动脉夹夹闭双侧颈总动脉5 min，5 min后取下。共重复3次。大鼠在4条血管阻断后1～2 min内，翻正反射消失且虹膜变白及瞳孔散大，视为造模成功。保证每组至少10只。

1.3 治疗

VD穴位埋线组：术后第7天后开始治疗，整个治疗周期只埋线一次，选择百会、膈俞、气海、三阴交、膻中五穴，膈俞(双穴)和三阴交(双穴)，选穴及定位参照《实验针灸学》[6]提供的方法，并模拟人体腧穴骨度分寸法量取。治疗方法：将大鼠麻醉后固定，将可吸收性外科缝线剪成若干段，每段1～2 cm，消毒备用。使用镊子将剪好的可吸收外科缝线装入埋线针具。穴位皮肤消毒，将埋线针具刺入穴位，然后将羊肠线推入穴内。

VD尼莫地平组：尼莫地平按20 mg/(kg·d)用量，每天上午9∶00-11∶00进行灌胃治疗，连续治疗15天。

假手术组和VD模型组：蒸馏水1 mL/100 g灌胃，连续15天。

1.4 各组大鼠Morris水迷宫学习记忆能力检测

Morris水迷宫为圆形水池，直径100 cm，深50 cm，水深30 cm，水温(24±2)℃，将水池分为四个象限，不同象限壁上放置不同图型标志物，第三象限放置一个无色透明的逃生平台，没入水下2 cm左右，直径6 cm，高28 cm。先进行定向航行实验：将大鼠从第一象限池壁放入水中，测定大鼠找到逃生平台的时间，记录大鼠从水中爬上站台所需时间为逃避潜伏期。大鼠90 s内找到逃生平台，并在平台上停留(2～3 s)，视为找到平台，连续6天。第7天进行空间探索实验：将大鼠从第一象限入水点放入水池，记录90 s内大鼠在第Ⅲ象限游泳时间和穿越站台次数。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 ELISA检测血清中PGE2含量 采集各组大鼠血清标本，购买相应试剂盒，按照说明书进行操作。

1.5.2 Western blotting检测各组大鼠海马CA1区COX-2蛋白表达 称取海马组织加入适量RIPA(细胞裂解液)提取液提取蛋白离心，收集上清液，再按细胞蛋白提取试剂盒说明进行蛋白提取，检测蛋白浓度。将制备好的蛋白样品加入凝胶中电泳，转膜，取膜。一步法快速WB试剂盒将其加入封闭液中，用蒸馏水将一步法试剂盒中的10×洗液稀释为1×洗液；将二抗HRP放入离心管，使一抗与二抗充分混匀，于室温条件下孵育。漂洗去掉抗体混合液，洗液清洗3次，每次洗液漂洗。在反应盒内加入高灵敏度化学发光检测试剂盒A液及B液，混匀，放入PVDF膜，使膜表面与试剂充分接触5 min，放于凝胶成像仪中，选择化学发光，开始曝光。照相并保存，用化学发光凝胶成像系统软件进行图像分析，采用目的蛋白与内参的比值来表示蛋白表达水平。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 Morris水迷宫行为学检测结果

相比于假手术组，VD模型组平均逃避潜伏期延长(P<0.01)，第3象限活动时间缩短，穿越平台次数减少(P<0.01)；相比于VD模型组，VD穴位埋线组平均逃避潜伏期缩短(P<0.05)，第3象限活动时间延长、穿越站台次数增多(P<0.05)，表明穴位埋线能够改善大鼠认知状况和记忆能力，见表1。

组别平均逃避潜伏期(S)第3象限活动时间(S)穿越平台次数VD模型组84.98±18.83▲19.57±9.19▲0.66±1.21▲VD穴位埋线组48.98±14.69△40.31±8.97△2.50±1.04△VD尼莫地平组30.97±10.96△57.03±11.88△3.33±2.16△假手术组23.98±11.5868.15±13.046.00±1.41

注：与假手术组比较，▲P<0.01；与VD模型组比较，△P<0.05。

2.2 ELISA检测VD大鼠血清PGE2水平

相比于假手术组，VD模型组大鼠血清中PGE2表达升高(P<0.05)；相比于VD模型组，穴位埋线组大鼠血清中PGE2表达水平降低(P<0.05)。PGE2作为非常关键的促炎因子，其表达降低提示VD大鼠脑组织中炎症减轻。穴位埋线以及尼莫地平都可以降低PGE2的表达，见表2。

2.3 Western-blot检测 VD大鼠海马CA1区中COX-2蛋白表达量的变化

相比于假手术组，VD模型组海马CA1区中COX-2表达上升(P<0.05)；相比于VD模型组，穴位埋线组大鼠海马CA1区COX-2表达水平降低(P<0.05)。COX-2高表达能促进炎性细胞因子生成，加重炎症反应，其表达降低揭示了VD大鼠组织中炎症减轻。穴位埋线以及尼莫地平都可以降低CA1区COX-2的表达，见表2，图1。

组别血清PGE2含量(pg/mL)CA1区COX-2表达假手术组190.77±6.83864.96±83.35VD模型组545.59±31.42▲2352.95±230.35▲VD穴位埋线组362.56±23.66△1562.97±194.19△VD尼莫地平组246.92±17.81△1101.42±165.80△

注：与假手术组比较，▲P<0.05；与VD模型组比较，△P<0.05。

图1 VD大鼠海马CA1区中COX-2蛋白表达量的变化蛋白电泳

3 讨论

血管性痴呆(VD)属于中医学“呆病”范畴，病位在脑，与五脏六腑的联系也非常紧密，病机多属本虚标实，气滞血瘀。《灵枢》曰：“脑为髓海，髓海不足则脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧”[7]，认为髓海不足是该病最主要的病机之一。《血证论》指出：“凡心有瘀血也令人健忘”，阐述了痰瘀互结，脑络不通，髓海失养，从而导致记忆能力下降。针对“呆病”的治疗，各派医家也有各自的见解，主要从脏腑辨证论治和八纲虚实辨证论治两方面辨证治疗。治疗手段主要为中药汤剂辨证治疗和针灸治疗相结合。研究表明，当归补血汤可补气生血，从而改善VD大鼠的学习记忆能力[8]。针刺能降低脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺损评分，实现脑保护作用[9]。穴位埋线可以调节脑内神经细胞代谢，刺激脑内神经元细胞的活跃，减轻神经功能受损程度[10]。本课题取百会、膈俞、气海、三阴交、膻中等穴位，达到醒神开窍的作用。百会穴位于督脉上，是督脉的第一要穴，是督脉与足太阳膀胱经的交会穴。督脉入络脑，与“元神”相系，主治神志病，而百会穴为督脉阳气至盛之穴，故百会可升举阳气、开窍醒神，是治疗“呆病”的主穴[11]。远端取穴法取膈俞、气海、膻中、三阴交，可补益气血。诸穴合用，最终达到补气生血、开窍醒神的作用。

现代医学认为，VD是由脑血管病变导致脑组织血液供应障碍，脑组织由于缺血导致损伤，从而导致大量神经元受损，最终导致认知功能障碍为主要症状的一种疾病。有大量研究表明，脑缺血损伤后会发生炎性反应，炎性反应可修复受损组织，具有神经保护作用，但过度表达又可加重脑组织损伤。脑缺血再灌注会加重脑部的损伤，加重炎性反应。研究表明，COX-2参与多种疾病的炎症反应过程，是导致炎症性疾病的重要机制之一，炎症发生后COX-2表达增加，并随炎症的加重而增高，而在大脑缺血性损伤的过程中，最容易受损的部位是海马CA1区，最终导致学习记忆障碍[12]。本实验通过四血管阻断法建立VD大鼠模型，研究穴位埋线对VD大鼠海马CA1区COX-2水平表达的影响。结果提示，穴位埋线可使 COX-2表达受到抑制。

环氧化酶是花生四烯酸合成前列腺素类物质的重要酶，COX-2表达增加，使得前列腺素(PG)合成增加[13]。PGE2是关键的促炎因子，在调节炎症中起着核心作用，前列腺素由人体内的花生四烯酸经过代谢后生成，它在人体内具有非常广泛的生理作用，与人体的炎症反应有密切的关系，并加重炎症的发生。实验结果提示，脑缺血再灌注后VD大鼠血液中PGE2的表达增加，穴位埋线组以及尼莫地平组大鼠血液中PGE2表达水平均降低。大鼠经过前期的引导学习后，根据水迷宫行为学检测实验结果可看出，与VD模型组比较，穴位埋线组第3象限活动时间明显延长、穿越站台次数明显增多。表明穴位埋线可改善VD大鼠的学习记忆能力。

综上所诉，穴位埋线可能通过抑制VD大鼠脑海马CA1区COX-2和血清PGE2的表达，从而改善VD大鼠脑损伤引起的炎症反应，实现脑保护作用，提高大鼠的学习记忆能力，但其具体的作用机制尚未明确，需进一步研究。