不同产地垂盆草中有效成分对比研究

兰 杨，姜 红，张仕瑾，彭贤东*，郭廷东，唐志立

(1.南充市中心医院/川北医学院第二临床医学院 药学部 个体化药物治疗南充市重点实验室，四川 南充 637000；2.彭州市人民医院 药学部，四川 成都 611930)

垂盆草为景天科植物垂盆草(SedumsarmentosumBunge)的干燥全草，具有清热解毒、利湿退黄的功效，临床主要用于治疗湿热黄疸、小便不利、痈肿疮疡等，将其制成垂盆草颗粒能有效改善肝功能[1-2]。目前，从垂盆草中分离得到的化合物主要有生物碱、黄酮、三萜类、挥发油等，其中黄酮类是其最主要的有效成分，具有护肝、免疫调节和抗肿瘤的作用[3-4]。垂盆草分布于全国各地，但有文献表明鲜品垂盆草化学成分受产地和采收季节影响较大[5]。因此本文建立高效液相色谱法测定不同产地垂盆草中3种有效成分(槲皮素、山柰素、异鼠李素)的含量，旨在对比不同产地垂盆草中的化学成分，以期为优选垂盆草药材资源提供参考依据。

1 材料与试剂

1.1 仪器

Agilent 1020型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；电子天平(JY2000，上海方瑞仪器有限公司)；超声波清洗器(KQ5200DB，昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2 试药与试剂

山柰素(中国食品药品检定研究院，批号：110861-201611，含量以95.5%计)，槲皮素(中国食品药品检定研究院，批号：100081-201610，含量以99.1%计)，异鼠李素(中国食品药品检定研究院，批号：110860-201611，含量以99.8%计)；编号S1～S15的垂盆草药材分别来自湖北、安徽、四川，样品信息见表1；乙腈和乙酸为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

表1 样品来源信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Welchrom C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.1%乙酸水溶液-乙腈，采用梯度洗脱，程序为0～5 min，15%乙腈；5～25 min，15%～18%乙腈；25～40 min，18%～23%乙腈；40～50 min，23%～30%乙腈；50～75 min，30%～35%乙腈；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；检测波长：360 nm。

2.2 对照品溶液制备

取槲皮素对照品、山柰素对照品、异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含槲皮素52 μg、山柰素18 μg、异鼠李素15 μg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取本品粉末(过二号筛)约0.5 g，精密称定，精密加入甲醇-25%盐酸溶液(4∶1)混合溶液25 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇-25%盐酸溶液(4∶1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 专属性试验

在上述色谱条件下，精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL，进样分析，记录色谱图。结果，供试品色谱中槲皮素、山柰素、异鼠李素能与其他杂质峰基线分离(见图1)。

1-槲皮素;2-山柰素；3-异鼠李素

2.5 线性关系考察

分别吸取“2.2”项下混合对照品溶液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得系列对照品溶液。分别精密吸取上述系列对照品溶液各10 μL，按照“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。以浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，得槲皮素回归方程：Y=47.813X-11.38(R2=0.999 8)；山柰素回归方程：Y=1.279X+2.84(R2=0.999 8)；异鼠李素回归方程：Y=15.907X-1.48(R2= 0.999 6)。

2.6 精密度试验

取“2.2”项下混合对照品溶液重复进样6次，记录峰面积，计算RSD。结果，槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积的RSD分别为0.51%、1.41%、0.56%，结果表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取本品粉末(过二号筛)约0.5 g，精密称定，共6份，按照“2.3”项下制备方法制备供试品溶液，分别精密吸取各供试品溶液10 μL，按照“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，计算含量。结果槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量分别为：0.04%、0.31%、0.03%，RSD分别为0.95%、0.54%、1.21%，结果表明方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10 μL，按照“2.1”项下色谱条件分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h进样分析，记录峰面积。结果对照品峰面积RSD分别为0.98%、1.05%、0.67%，供试品峰面积RSD分别为0.78%、0.89%、0.96%。结果表明，混合对照品溶液与供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.9 回收率试验

取已知槲皮素、山柰素、异鼠李素含量的本品粉末约0.25 g，精密称定，共6份，分别精密加入混合对照品溶液适量，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取10 μL，按照“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，计算含量。结果槲皮素、山柰素、异鼠李素的平均回收率为98.7%、99.3%、101.5%，RSD分别为0.87%、1.15%、0.59%，结果表明方法准确度良好。

2.10 含量测定

取上述3个产地15批垂盆草药材，按照“2.2”项下方法制备样品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，按照所得对照品的标准曲线计算样品中槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量，得到三者的总含量，结果见表2和图2。由结果可知，3个产地中，湖北产地总含量最高，而安徽和四川产地总含量差异较小。

表2 不同产地槲皮素、山柰素、异鼠李素总含量测定结果 (n=3，%)

注：*表示与湖北黄冈比较，差异具有显著性(P<0.05)。

注：*表示与湖北黄冈比较，差异具有显著性(P<0.05)。

3 讨论

本文在建立液相条件过程中，分别考察了0.1%乙酸水溶液-乙腈、0.05%乙酸水溶液-乙腈和0.1%甲酸水溶液-乙腈3种流动相，最终发现0.1%乙酸水溶液-乙腈为流动相时，各色谱峰分离效果最佳，故选择0.1%乙酸水溶液-乙腈为本试验的流动相。通过测定全波长下的色谱图，发现垂盆草在360 nm处吸收强度最大，各峰形和峰高均较好，故本试验选择360 nm为检测波长。

三个产地15批垂盆草含量测定结果表明，不同产地垂盆草中有效成分含量以湖北黄冈产地平均含量最高，而安徽亳州和四川达州平均含量差异较小。这也提示不同产地垂盆草的化学成分含量具有差异性，这可能是受当地土壤、雨水量、温度、相对湿度和光照等自然因素的综合影响。已有文献[6]报道，控制土壤含水量在70%～80%时，可同时保证垂盆草药材产量和活性成分含量。本实验建立的含量测定方法可为垂盆草提供简单、准确的质量控制方法，对比垂盆草药材三个产地含量差异可为优质垂盆草资源的采购及研究提供参考依据。