龟鹿二仙胶对去势大鼠骨骼肌Akt蛋白表达的影响

陈竑明，徐 杰

(1.福建中医药大学 中医学院，福建 福州 350100；2.福建医科大学附属福建省立医院，福建 福州 350001)

骨质疏松症是由于多种原因导致的骨量下降，结构破坏，脆性增加，跌倒和骨折发生风险升高的一种全身性骨病。多见于绝经后女性和老年人。近年来对于骨质疏松的研究大多集中在对骨的“质”和“量”的方面，而忽视了骨骼肌。早期有对绝经后妇女的临床研究表明[1]：老年人的骨骼-肌肉系统的退行性变会造成骨量减少，进而引起运动能力下降、骨脆性增加，增加骨折的发生概率，最终导致老年人生活质量下降。肌肉的协调性紊乱或平衡性障碍是导致摔倒、骨质疏松骨折的主要诱因。近期也有国内专家提出[2]，肌肉和骨骼共同组成运动系统，两者的分泌因子和应力关系对对方有重要的影响，故骨质疏松的治疗上也应该二者共同着手。Akt蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与调控细胞的代谢、增值、凋亡、生存等。Akt在哺乳动物有3个家族基因(Akt1、Akt2、Akt3)，有研究表明[3]Akt1、Akt2基因敲除的大鼠表现为骨骼、肌肉的发育不全，故Akt基因、蛋白与肌肉骨骼的发育密切相关。另外，国内近年有研究表明[4-5]，2.5月龄雌性大鼠去势3月后，骨组织Akt1、Akt2基因、蛋白表达水平相对空白组反而升高，考虑破骨细胞活性大于成骨细胞，但肌肉组织表达水平是下降的。因此，提出检测骨质疏松大鼠的骨骼肌Akt蛋白、基因水平也是很有意义的。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康的雌性未孕清洁级SD大鼠40只，体重(200～220 g)，3月龄，购于上海莱克斯动物实验公司，生产许可证号：SCXK(沪)2012-0002，委托福建省中医药研究院清洁级动物房正常喂养至6月龄，体重约(270～300 g)，后续继续喂养、干预于福建省中医药研究院清洁级动物房。实验过程完全符合福建省中医药研究院伦理委员会标准。

1.2 主要仪器及试剂

总Akt多克隆鼠抗、总p-Akt(Ser-473)多克隆鼠抗以及β-actin多克隆鼠抗(均购于美国Proteintech公司)，R401-RNA分离液总RNA提取试剂(购于南京诺维赞公司)，拜耳戊酸雌二醇片(批号：J20171038)；龟鹿二仙胶各药配伍为：鹿角胶6 g，龟甲9 g，枸杞子9 g，人参6 g，药材购自福建中医药大学国医堂浓缩中药颗粒剂药房(浓缩比例分别为鹿角胶1∶1，龟甲1∶10，人参1∶5，枸杞子1∶5)。

1.3 模型制备及分组

将喂养至6月龄的40只SD大鼠，按随机数字表法分为假手术组(n=10)、模型组(n=10)、中药组(n=10)，雌激素组(n=10)。四组大鼠均腹腔注射：①动物称重，用2%戊巴比妥钠片40 mg/kg腹腔注射麻醉；②腹部正中切口，探及左右端卵巢，假手术组切除卵巢周围适量脂肪，行结扎切除术，往术口内滴入少量青霉素溶液，缝合伤口，碘伏消毒术口；③术后3天连续给予肌注青霉素预防感染(8万单位/只)；④缝合切口后普通饲料喂养、自由饮水和活动。

1.4 干预方法

术后第二周开始灌胃。按人与大鼠体表面积换算法给药，人与大鼠给药比约为1∶6.3，使用人临床用药的中剂量(鹿角胶 540 mg/kg、龟甲 81 mg/kg、人参108 mg/kg、枸杞 162 mg/kg)中药组给方剂量为 5.1 g/kg，雌激素组采用戊酸雌二醇片，生理盐水稀释，以 0.104 mg/kg灌胃，固定每天早晨9点。假手术组、模型组与等量生理盐水灌胃。连续干预12周。

1.5 指标检测

1.5.1 活体骨密度(BMD)和骨矿含量(BMC)测定 应用福建省中医药研究院小动物双能X线(美国HOLOGIC DISCOVER W型双能X线骨密度仪)，10%水合氯醛麻醉，对各组大鼠腰椎和双下肢进行活体BMC和BMD的测量。

1.5.2 标本采集 双能X线检测后，隔天用2%戊巴比妥钠片40 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速分离大鼠双层腓肠肌，生理盐水冲洗数秒，放入冻存管后迅速移动至液氮罐中保存，24 h后移至-80 ℃冰箱保存。

1.6 指标检测

1.6.1 RT-PCR检测腓肠肌Akt-1的mRNA的表达量 预先制备好琼脂糖凝胶，从-80 ℃取出组织块，切取约50 mg组织块，放入2 mL EP管中，加入1 mL Trizol和两颗直径0.3 mm磁珠，放入研磨机研磨60 s，频率60 Hz。研磨后加入氯仿200 mL离心，取上清400 mL移至新EP管，加入异丙醇400 mL离心、沉淀、弃上清液。加入75%乙醇离心、沉淀、弃上清液，重复3次，加入约200 μL DEPC水稀释。采用紫外分光光度计检测提取的RNA质量。进行反转录：50 ℃ 15 min，85 ℃ 2 min，进行PCR反应：94 ℃ 3 min→(94 ℃10 s→55 ℃ 15 s→72 ℃ 1 min)×35个循环→72 ℃ 5 min，在凝胶中每孔上样8 μL，横流100 mA电泳。Bio-rad成像仪拍摄图像，Image Lab 3.0分析荧光强度。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6.2 Western Blot检测骨骼肌总Akt表达量及Akt磷酸化水平 预先在每个2 mL EP管中加入1 mL增强型RIPA裂解液、10 μL广谱蛋白酶抑制剂、10 μL广谱磷酸化酶抑制剂、2颗直径3 mm磁珠，切取约100 mg腓肠肌组织，低温迅速匀浆、离心、沉淀，取上清800 μL，分装。加入上样缓冲液后，95 ℃变性10 min，10%浓度SDS-PAGE凝胶电泳。电泳后取出凝胶，220 mA横流转膜60 min至0.45 μm聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF膜)。3%牛血清蛋白封闭液室温摇床封闭2 h。一抗用一抗稀释液稀释1∶5 000，4 ℃摇床孵育16～17 h；TBST摇床清洗(3×10 min)，二抗用二抗稀释液稀释1∶5 000，室温摇床孵育1 h。TBST摇床清洗(3×10 min)。均匀在PVDF膜上滴加高效化学发光显影液，静置1 min，用bio-rad成像系统在暗室下曝光20 s，曝光20张图，间隔1 s，保存图像。以β-actin为内参，用Image Lab 3.0分析图像并计算光密度值。

1.7 统计学分析

运用SPSS 19.0统计学软件进行实验数据分析，结果以(均值±标准差)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较则采用LSD多重检验分析。

2 结果

2.1 各组大鼠活体腰椎及下肢骨密度

治疗12周后，模型组BMD明显低于假手术组(P<0.05)，说明骨质疏松大鼠模型成功，中药组和雌激素组BMD明显高于模型组(P<0.05)，中药组和雌激素组骨密度无明显差异(P>0.05)。说明雌性去势骨质疏松大鼠造模成功。结果见表2。

组别BMD(g/cm2)假手术组2.10±0.03#模型组1.92±0.04龟鹿二仙胶组2.01±0.05#∗雌激素组2.00±0.04#&

注：#与模型组比较(P<0.05)；*与雌激素组比较(P>0.05)；&与中药组比较(P>0.05)。

2.2 各组大鼠腓肠肌组织Akt1mRNA表达量

模型组Akt1mRNA表达量明显低于假手术组(P<0.05)，雌激素组和龟鹿二仙胶组高于模型组(P<0.05)，而雌激素组和龟鹿二仙胶组无明显差异(P>0.05)。结果见表3。

组别Akt1/GAPDH假手术组0.995±0.055#模型组0.5065±0.095龟鹿二仙胶组0.7625±0.1025#∗雌激素组0.7315±0.0615#&

注：#与模型组比较(P<0.05)；*与雌激素组比较(P>0.05)；&与中药组比较(P>0.05)。

2.3 各组大鼠腓肠肌组织Akt蛋白表达量

模型组Akt以及p-Akt蛋白表达量明显低于假手术组(P<0.05)，雌激素组和龟鹿二仙胶组高于模型组(P<0.05)，而雌激素组和龟鹿二仙胶组无明显差异(P>0.05)。结果见表4、表5。

组别Akt/β-actin假手术组0.806±0.053#模型组0.321±0.034龟鹿二仙胶组0.551±0.044#∗雌激素组0.522±0.066#&

注：#与模型组比较(P<0.05)；*与雌激素组比较(P>0.05)；&与中药组比较(P>0.05)。

组别p-Akt/β-actin假手术组0.456±0.030#模型组0.194±0.024龟鹿二仙胶组0.329±0.060#∗雌激素组0.323±0.052#&

注：#与模型组比较(P<0.05)；*与雌激素组比较(P>0.05)；&与中药组比较(P>0.05)。

3 讨论

骨质疏松症最严重的并发症是骨质疏松骨折，而肌肉的协调性紊乱或平衡性障碍是导致摔倒、骨质疏松骨折的主要诱因[6]。而目前大多数治疗集中于提高骨密度和改善骨骼微观结构上，近年来一些基础研究开始关注骨骼肌，但临床研究仍比较少。骨骼-肌系统的发育、功能及衰老是一个有机整体，骨骼肌数量是决定骨密度的重要因素，骨骼肌的丢失可导致骨密度下滑；肌肉萎缩、肌力下降和肌肉功能减退会导致骨皮质吸收加速、变薄、对抗外力能力变弱。骨骼所承受的力学刺激转化为生化信号调节骨密度。骨密度下降正是骨骼-肌肉系统调节失衡的结果。肌肉与骨骼二者位置相邻，功能相辅，并受到神经、内分泌、免疫、营养、力学刺激的系统调节，以及两者间内分泌、旁分泌和机械力学的局部相互调节[2]。

国内前期研究显示，去势骨质疏松大鼠的骨骼肌凋亡程度明显高于假手术组[7]。Akt参与多途径调控细胞的凋亡[8]：激活IKKα降解NF-κB的抑制剂IκB、抑制BAD与Bcl-2结合、减弱Caspase-9活性、磷酸化FoxOs来抑制促凋亡基因的转录以及通过磷酸化鼠微粒蛋白增加P53蛋白的降解等。Akt在参与调控多途径的细胞凋亡通路时，能活化Akt激活mTOR蛋白[9]，活化的Akt/mTOR通路能够诱导骨骼肌细胞的肥大。Akt发挥其功能主要依靠其磷酸化程度[8]，Thr308位点的磷酸化表示Akt的部分活化，而Ser473位点的磷酸化程度表示Akt是否完全活化，以此来调控细胞的生长和增殖。

中医认为“脾主四肢肌肉”，脾主运化，是气血生化之源，后天之本。年老体衰，或大病，久病之后，元气未复，失于调养，均可使脾气亏虚，运化功能失常，导致气血生化乏源，筋骨形体失养，形体瘦削。骨质疏松的主要病机是肾虚、脾虚。《难经》有云：“足少阴气绝，则骨枯。少阴者，冬脉也，伏行而濡骨髓者也，故骨不濡，则肉不能着也；骨肉不相亲，则肉软却；肉软却，故齿长而垢，发无泽；发无泽者，骨先死。”《注解伤寒论》述：“脾合荣气，荣养骨髓，实肌肉，濡筋络。”脾主运化，运输水谷精微，外充肌肉，内滋骨髓。肾阳亦可温煦脾阳，脾气充足则气血旺盛。龟鹿二仙胶出自《医便》，功用为滋阴填精，益气壮阳。方中鹿角、龟板二味最能补阴阳生精血，共为君药。配伍枸杞子益肝肾，补精血，更用人参补后天，益中气，增强气血化生之源。纵观全方，阴阳并补，气血兼顾，既能滋补肝肾，又能补益脾胃。近年来有相关临床研究证实，龟鹿二仙胶能减轻绝经后骨质疏松患者骨痛、提高患者骨密度，并且能提高患者血液雌二醇、睾酮[10]水平。骨骼与肌肉二者虽是高度分化的组织，但同由间充质干细胞分化而来，在治疗上可能存在一些共同的靶点。雌激素[11]可以激活Akt上游因子PI3K进而活化Akt蛋白发挥生物效能，早期也是作为提高骨密度和骨骼肌力量的经典用药[12]。本研究提示龟鹿二仙胶能提高骨骼肌Akt蛋白、基因水平，抑制骨骼肌细胞凋亡并且促进其增殖、肥大，为龟鹿二仙胶从肌肉-骨骼系统上治疗骨质疏松症提供了新的依据。