EGFR突变对非小细胞肺癌预后的影响

冒学莲, 杨翊柠, 汤珣, 竺明晨, 王承霞, 陈艳, 严枫

肺癌是我国目前发病率、死亡率均居于高位的恶性肿瘤之一,40%～80%的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)表达上调[1-2],EGFR外显子18～21编码该受体的功能域[3],且EGFR突变只可见于肿瘤组织[4-5],却在正常的组织中不可见,可作为NSCLC有效治疗的靶点之一[6-7]。研究NSCLC患者EGFR基因的突变情况,预测针对性地靶向治疗,受用人群的预后生存,具有很重要的临床意义[8]。本研究采用高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)对EGFR基因18、19、20和21外显子突变情况进行分析,结合临床病理特征,探讨EGFR基因突变对NSCLC患者治疗及预后的价值,揭示总生存期(overall survival,OS)≥3年的生存特点。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集南京医科大学附属肿瘤医院2013年1月1日至2018年6月30日的临床病理资料完整的,且经病理学确诊为NSCLC,石蜡包埋组织标本349例。男性206例,女性143例。年龄28～85岁,中位年龄61岁。60岁以下的占43.6%。67.9%(237/349)的患者有淋巴结转移。21.5%(75/349)的经常吸烟。根据2016年国际抗癌联盟(UICC)新的修订标准,进行NSCLC的TNM分期,其中Ⅰ～Ⅱ期45例,Ⅲ～Ⅳ期304例。腺癌321例,其他28例为鳞癌、腺鳞癌,神经内分泌癌等。使用靶向药物治疗203例,铂类药物化疗146例。纳入标准:①细胞学或者组织学确诊NSCLC;②年龄≥18岁;③做过EGFR基因检测;④临床资料完整;⑤心电图、血常规、生化检查基本正常;⑥可以定期随访,依从性比较好。排除标准:①因患者自身原因,无法接受治疗;②原发其他系统的恶性肿瘤;③合并控制不佳的的糖尿病;④合并有其它危及患者安全,或影响本研究结果的器质性疾病。研究获得本院医学伦理委员会的批准。

1.2 主要仪器和试剂 Nanodrop1000定量测定仪(Thermo公司),lightCycle-480实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司),ABI 3500 XL基因分析仪(美国ABI公司)。FFEP-DNA提取试剂盒(美国QIAGEN公司),EGFR基因突变检测试剂盒(苏州为真公司)。

1.3 EGFR突变检测 取1.5 ml EP管1支,依据组织大小的情况,切5～10片10 μm厚度的石蜡包埋样本,加入二甲苯脱蜡,待无水乙醇彻底挥发干燥后,使用FFEP-DNA试剂盒,按照其操作步骤提取组织DNA。使用Nanodrop1000定量测定仪,将提取的组织样本DNA进行样本浓度检测。检测完毕后,将DNA样本统一稀释至30 ng/μl,作为扩增模板,-20 ℃保存备用。采用light Cycler-480实时荧光定量PCR仪,检测EGFR基因外显子18、19、20和21的突变,反应体系为light Cycler HRM Master Reaction Mix(Roche) 20 μl,模板为2 μl(30 ng/μl),滴加石蜡油。进行HRM-PCR扩增程序:第一阶段:酶激活,95 ℃预变性10 min。第二阶段:PCR扩增,95 ℃10 s,65 ℃15 s,72 ℃25 s,50个循环检测荧光。第三阶段:熔解,95 ℃1 min, 40 ℃1 min,65 ℃～90 ℃,每0.02 ℃收集熔解曲线数据。第四阶段:4 ℃冷却10 s。结束反应后,带有荧光信号的曲线分析检测结果。判读标准:① Ct<26;② ΔCt=突变Ct-外控Ct,26≤Ct<29,ΔCt≤7(G719X突变),ΔCt≤8(L861Q突变、S7681突变),ΔCt≤11(L858R突变、19-del突变)。对于HRM检测结果阳性的样本,将重新对样本进行PCR扩增,用ABI 3500XL基因分析仪进行直接测序,分析测定结果。

1.4 随访及观察指标 随访方式包括电话、门诊复查和住院复查。观察指标是OS,无进展生存率(progression free survival,PFS)。患者每两个化疗周期后复查MRI,CT或骨扫描。治疗期间如有不适则随时复查。PFS表示由治疗开始直到有任意客观证据证实疾病出现进展止,如无进展者则至末次随访时间止。OS表示由确诊之日起,死亡之日止,如有生存者则至末次随访时间止,其生存数据为截尾数据。

1.5 统计学方法 研究所得数据录入SPSS 20.0进行统计,计数资料用例(%)表示,组间比较采用χ2检验。使用Kaplan-Meier法绘制生存函数曲线,对比组间PFS和OS。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR基因突变情况 349例患者中,共176例发生EGFR突变,突变率为50.4%,其中17例为双突变,占4.9%。8例19和21双突变,2例18和21双突变,4例20和21双突变,2例19和20双突变,1例18和20双突变，详见表1。

2.2 EGFR基因突变与临床特征的分析 经分析对比,EGFR基因总突变率女性(62.2%)高于男性(42.2%)、腺癌(52.0%)高于非腺癌(32.1%),差异具有统计学意义(P<0.05);不同年龄、TNM分期、吸烟情况、淋巴结转移,差异无统计学意义(P>0.05)。<60岁的患者EGFR基因19突变率(28.9%)高于≥60岁的患者(19.8%),差异具有统计学意义(P<0.05);不同性别、病理类型、吸烟情况、TNM分期、淋巴结转移,差异无统计学意义。≥60岁患者的21突变率(32.0%)高于<60岁患者(19.1%),女性患者的21突变率(37.8%)高于男性(18.4 %),差异具有统计学意义(P<0.05);不同吸烟情况、病理类型、TNM分期、淋巴结转移,差异无统计学意义。EGFR基因18、20和双突变率,不同年龄、性别、病理类型、吸烟情况、TNM分期、淋巴结转移,差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1 349例非小细胞肺癌中的EGFR突变类型(%)

表2 349例NSCLC中EGFR突变与临床特征的分析(例)

2.3 PFS分析 截至2018年12月15日,剔除失访者,有249例患者具有完整的预后随访资料,其中118例未发生研究终点事件,131例死亡。EGFR基因总突变和21突变PFS生存率高于野生型患者,差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.4 总生存率分析 全组249例随访患者中,中位生存时间为23个月,最高生存时间达到12年以上。分别进行存活3个月、1年、2年、3年、5年生存率的统计,结果分别是97.2%、84.3%、48.2%、32.1%、9.6%。EGFR基因总突变和21突变的生存率的差异,仅1年生存率差异有统计学意义(P<0.05)。EGFR18、19、20双突变生存率差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.5 OS≥3年和OS≤1年患者临床特征对比分析

OS≥3年有80例,中位生存时间为51.5月,最高生存时间达到12年以上,OS≤1年有39例,中位生存时间为9个月。OS≥3年和OS≤1年在性别、TNM分期、淋巴结转移、EGFR总突变率、21的突变率及靶向治疗率方面差异有统计学意义(P<0.05),在年龄、吸烟及病理类型方面差异无统计学意义(P>0.05)。15例双突变的患者总生存率均在1年以上,其中6例总生存率达到3年以上，见表4。

1A:EGFR基因总突变型与野生型PFS生存曲线;1B:EGFR基因21突变型与野生型PFS生存曲线图1 EGFR基因突变的PFS生存曲线

表3 249例中EGFR基因突变总生存率对比分析(例)

表4 OS≥3年和OS≤1年临床特征对比分析[n(%)](例)

注:F为Fisher精确检验

3 讨论

HRM分析法是近几年新兴的遗传突变扫描和基因分型诊断技术,具有准确、敏感、快速的特点。HRM分析法通过熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异,核酸的碱基组、序列和长度的不同导致了形状不同的熔解曲线。文献中18～21外显子没有单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的报道,满足HRM方法的检测的要求。Lin等[9],王卓等[10]已经论证,HRM法的检测特异性为100%。本试验采用HRM方法检测完全可行。

本研究中有50.4 %NSCLC患者检测到EGFR基因突变。和Wang等[11],Shen等[12]研究结果相一致,但是比王卓[10](43.5%)略高,更高于谈云[17](26.67%)胸水的检出率。EGFR基因19(47.2%)、21(52.3%)为主要突变,与Li等[3]19(42.3%)、21(47.1%)相近。中国人群中,有着高比例的EGFR基因突变率。EGFR基因突变和针对性的靶向治疗对于研究NSCLC患者的生存预后有着重要的影响。女性、腺癌是EGFR基因突变的高危因素,是选用TKI治疗的优势人群,与Zhao等[15-16]的研究结果相似。推测EGFR基因突变可能和雌激素有一定关系,EGFR通路和雌激素受体间存在相互作用。因此,在选用TKI治疗时优先考虑具备这些条件的患者。患者中有着EGFR突变,尤其是外显子21的突变的患者,PFS和OS能显著延长。具备以上条件的患者可以尝试针对性靶向治疗,提高生存时间。

15例双突变的患者总生存率均在一年以上,其中6例总生存率达到3年以上。双突变的患者可以使用的EGFR-TKI的范畴更广,即使1种突变耐药之后,还可以使用另1种TKI,减少药物使用的空档期,更有效地控制肿瘤的进展。对21突变的结合敏感性更高,多发伴随CMET通路的打开和T790的耐药突变。CMET和T790抑制剂的使用使得21突变的患者可能获得更高收益。疾病的治疗过程中具有以上特征的患者,在排除禁忌证的前提下,都可以尝试使用靶向药物进行治疗,提高总体生存时间。

目前的研究存在很多局限性。首先,研究采取回顾性设计,由于排除因素的多样性,被选择的患者存在偏倚性。第二,由于医保政策的局限性,治疗期间的临时限制,患者和医生的共同参与,超过一半的患者接受了化疗作为一线治疗。而部分患者在当一线化疗没有明显效果,选择靶向药物的时候,病程已是晚期,靶向的选择也有所偏差。这可能导致组之间的偏差。第三,本研究后期收集的研究对象,使用的靶向药物频率比较高,而观察时间相对比较短,以致PFS观察较短,可以继续随访,增加观察时间,提高数据的可说服力。