一株海洋来源蛋白酶产生菌Parengyodontium album HX2019006的鉴定及其发酵条件研究

傅奇，林俊杰，庄峙厦，黄华斌，孙恩贤，甘美裕，肖玉娟

(厦门华厦学院，福建 厦门，361024)

蛋白酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品生产、畜牧养殖、皮革制造与环保产业。海洋微生物由于其生存环境与陆地微生物不同，在蛋白酶的结构、产酶能力和发酵条件等方面往往存在特殊性，是新蛋白酶生产菌种的重要来源。CHI等从青岛市盐湖地区的沉积物中分离出高产蛋白酶的酵母菌株Aureobasidiumpullulans[1]，ZHANG等在黄海的海洋细菌FlavobacteriumYS-80中发现了一种新的嗜冷海洋蛋白酶[2]，RAMESH等从孟加拉湾及其关联水域筛选得到1株产高温蛋白酶的链霉菌[3]，KUMAR等从韩国海滩筛选得到的1株BacillusClausii中分离得到了一种耐高温碱性蛋白酶[4]。

课题组从厦门市红树林海泥中筛选得到1株产蛋白酶的丝状真菌ParengyodontiumalbumHX2019006，可在海水培养基中发酵生产蛋白酶，其较优的蛋白酶发酵条件与报道的Parengyodontiumalbum产蛋白酶条件存在较大差异，具有进一步研究的价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验样本

分离菌株样本为海泥，于厦门市集美区红树林退潮后，采集表层下5 cm左右泥层，置于4 ℃冷藏，1周内完成稀释涂布[5]，使用前均质混匀。

1.1.2 培养基与试剂

2216E(液体)、2216E琼脂，青岛海博生物科技有限公司；蛋白胨、酵母浸粉、玉米浆粉，湖北安琪生物集团有限公司；海水晶，广州益尔生物工程有限公司；酪蛋白、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘油、尿素、硫酸铵、FePO4，国药集团化学试剂有限公司；真菌DNA提取试剂盒，北京全式金生物技术有限公司;ITS扩增引物ITS1: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′、ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3 仪器与设备

Aerisbg096 PCR仪，新加坡ESCO公司；HE99核酸电泳仪，美国GE公司；211B摇床，上海苏坤公司；LRH250生化培养箱，上海一恒公司；Quanta450扫描电镜，LFEI公司；UV2450分光光度计，岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理

取海泥25 g加入225 mL 2216E液体培养基均质，于外加3%(质量分数)葡萄糖和1%(质量分数)酪蛋白的2216E琼脂平板稀释涂布，30 ℃培养48 h，取有显著水解圈的单菌落进行纯化[6-7]。

1.2.2 细胞形态观察

纯化后的菌株划线接种至加入3%葡萄糖的2216E琼脂平板，将灭菌后的盖玻片45°斜插在划线路径上，30 ℃培养48 h，取插片送至自然资源部第三海洋研究所科学仪器共享平台，扫描电镜观察细胞形态。

1.2.3 菌种鉴定

用真菌基因组DNA抽提试剂盒，提取菌株的总DNA；用ITS引物扩增，所得PCR产物电泳纯化后，由厦门铂瑞生物科技有限公司测序。

ITS扩增条件为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。

将测序结果在Genbank进行比对，选择相似度较高的菌种序列，分别用BioEdit[8]和Clustal X[9]进行比对和编辑，取有效区间，采用最大简约算法，用Paup*4.0构建进化树[10-11]，选择TrichodermadeliquescensGJS 89-129[12]作为外群。

1.2.4 发酵条件优化

种子培养基使用成品2216E液体培养基加入3%(质量分数)葡萄糖。

初始发酵培养基参考2216E培养基成分配制(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母浸粉1，FePO40.01，海水晶30；用HCl/NaOH调节pH至7.5。

初始装液量为250 mL锥形瓶中装液50 mL，接种量10%，发酵时间72 h，发酵温度30 ℃，摇床转速100 r/min。

发酵液取离心后的上清液，按照GB/T 23527—2009蛋白酶制剂[13]中的福林法测定蛋白酶活力，以40 ℃、pH 7.5的条件下每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需酶量为1 U[14]。

发酵条件先按照碳源种类、碳源浓度、氮源种类1(替代蛋白胨)、氮源浓度1(蛋白胨部分)、氮源种类2(替代酵母浸粉)、氮源浓度2(酵母浸粉部分)、FePO4浓度、海水晶浓度、初始pH、接种量、装液量、发酵温度、发酵时间的顺序进行单因素逐步优化，再选择单因素实验中影响较大，且可能存在交互作用的因素用Design-Expert进行Box-Behnken响应面优化[15]。每组3个平行样，取平均值进行分析，预实验中摇床转速>100 r/min时较易形成菌丝团，因此暂不考察摇床转速对蛋白酶产量的影响。

2 结果与分析

2.1 菌株分离纯化

从海泥中筛选得到1株产蛋白酶丝状菌，菌落白色、绒毛状，产孢子，编号为HX2019006，细胞形态如图1所示。

A-1 600倍;B-1 000倍图1 HX2019006细胞扫描电镜图Fig.1 Scanning electron micrograph of HX2019006 cells

2.2 菌种鉴定

HX2019006菌株ITS序列经测序拼接后，得到603 bp有效序列，于Genbank进行比对，与Parengyodontiumalbum(旧称为Engyodontiumalbum[16]、Tritirachiumalbum[17])相似度最高，与多株Parengyodontiumalbum菌株相似度达99%以上。选择相似度较高的菌株及相近属代表菌株ITS序列构建进化树如图2所示。

树长为380，一致性指数(consistency index,CI)为0.768，保留指数(retention index,RI)为0.819，同性指数(homoplasy index,HI)为0.232。各分枝自展值较高，树形结构可靠，其中HX2019006菌株与Paren-gyodontiumalbum聚合在1枝，命名为Parengyo-dontiumalbumHX2019006。ITS序列上传至Genbank，序列号为MN944461。

Parengyodontiumalbum是一种重要的新型蛋白酶产生菌，其产生的蛋白酶K可高效水解角蛋白[18]，也是核酸提取过程中常用的蛋白水解酶。SAMAL 等从ParengyodontiumalbumLimber菌株中分离得到多种新型蛋白酶[19]。CHELLAPPAN等从1株海洋来源的Parengyodontiumalbum菌株中分离得到1种新型碱性丝氨酸蛋白酶，具有高储存稳定性，并耐受烃类、天然油脂、表面活性剂和多种有机溶剂[20]。对新菌株的蛋白酶和发酵条件进行分析具有重要的研究价值。

图2 基于ITS序列的进化树Fig.2 Phylogenetic trees based on ITS sequences

2.3 发酵条件优化

ParengyodontiumalbumHX2019006菌株在初始发酵条件下，蛋白酶产量为31.5 U/mL，单因素优化实验结果如表1所示。

表1 发酵条件单因素优化试验Table 1 Single factor optimization experiments of fermentation conditions

续表1

初始pH值pH5.56.57.58.59.5PA8.1(0.18)44.5(0.88)45.8(0.64)19.5(0.35)0(0.00)接种量比例2.0%6.0%10.0%14.0%18.0%PA26.1(0.41)40.4(0.94)45.4(0.53)45.9(1.09)42.5(0.69)装液量培养基体积25mL50mL75mLPA47.6(1.44)46.1(1.11)43.8(0.65)培养温度温度26℃28℃30℃32℃34℃PA18.5(0.33)44.3(0.87)46.8(0.98)52.6(1.66)24.7(0.55)培养时间时间24h48h72h96h120hPA7.2(0.22)29.3(0.69)53.4(1.03)61.7(1.48)63.2(1.06)

注：PA为蛋白酶活力(protease activity)，括号内为标准差，加粗部分为该组实验中综合选择的较优值

单因素优化实验中一般取蛋白酶活力最高的试验组开展后续实验，但在优势不显著时，综合成本与染菌风险选择较优值。FePO4浓度对蛋白酶活力影响小，选择不添加；接种量10%与14%差异不显著，选择较低接种量；装液25 mL与50 mL差异不显著，选择较大装液量；发酵96 h后酶活力增长较为缓慢，而染菌几率较大，选择96 h进行后续实验。

优化后的培养基为(g/L)：麦芽糖20，蛋白胨7.5，酵母浸粉2，海水晶15，初始pH 7.5。接种量10%，250 mL三角瓶装液50 mL，32 ℃培养96 h，蛋白酶活力达61.7 U/mL。其中麦芽糖浓度、蛋白胨浓度和培养时间对蛋白酶活力影响较大，且碳氮比、碳氮源量与培养时间之间可能存在交互作用[21-22]，因此，对这3个因素进行响应面优化，水平设置如表2所示。

表2 Box-Benhken试验设计因素与水平Table 2 Factors and levels of Box-Benhken experiments

以麦芽糖浓度、蛋白胨浓度和培养时间为自变量，蛋白酶活力为因变量进行试验，Box-Benhken试验设计及结果如表3所示。

表3 Box-Benhken试验设计及结果Table 3 Design and results of Box-Benhken experiments

注：括号内为标准差

二次回归方程拟合得蛋白酶活力(Y)对麦芽糖浓度(A)、蛋白胨浓度(B)和培养时间(C)的编码方程为Y=63.72+6.09A+12.38B+5.21C+3.87AB+2.5AC+4.33BC-6.41A2-11.49B2-6.41C2。模型方差分析如表4所示。

表4 回归模型方差分析表Table 4 Variance analysis of regression model

由表4中可知，模型极显著(P<0.01)，失拟项不显著(P=0.642 0>0.05)，回归模型的决定系数R2=0.999 2，校正系数R2=0.998 2,表明该模型与实验结果拟合较好，适用于对ParengyodontiumalbumHX2019006菌株蛋白酶发酵试验的分析与预测。各因素间的交互作用如图3所示。

A-蛋白胨质量浓度与麦芽糖质量浓度交互作用；B-培养时间与麦芽糖浓度交互作用；C-培养时间与蛋白胨质量浓度交互作用图3 三因素交互响应面Fig.3 Three-factor response surfaces

从图3可知，在麦芽糖和蛋白胨供应充足时，适当延长培养时间可获得较高的蛋白酶产量，根据回归方程预测，较优条件为麦芽糖29.03 g/L，蛋白胨9.64 g/L，培养时间为116.92 h时，预计可获得最高蛋白酶活力74.03 U/mL；为便于操作，按照麦芽糖29 g/L，蛋白胨9.6 g/L，培养时间117 h进行验证，实际蛋白酶活力为72.8 U/mL，与预计值基本一致。

鉴于117 h发酵时间过长，发酵过程中染菌发生率较高(96 h为9.5%，120 h为19.0%)，发酵液挥发较严重(50 mL装液量时，96 h平均挥发26%，120 h平均挥发34%)且周期过长。设置培养时间参数不超过96h时，方程预测较优条件为麦芽糖26.71 g/L，蛋白胨9.13 g/L，培养时间96 h时，预计可获得最高蛋白酶活力为69.80 U/mL；为便于操作，按照麦芽糖26 g/L，蛋白胨9 g/L，培养时间为96 h进行验证，实际蛋白酶活力为71.1 U/mL，综合考虑，选择此条件作为较优发酵条件，产酶量较响应面优化前提高15.2%，较最初培养条件提高了125.7%。

与该种的模式菌株ParengyodontiumalbumLimber产蛋白酶条件[23-24]相比，ParengyodontiumalbumHX2019006菌株产蛋白酶条件存在显著差异，一是HX2019006菌株耐盐，适于海水培养基生长，低盐条件下生长缓慢且产酶较低；二是较优发酵条件存在显著差异，除培养基组成差异外，HX2019006菌株较优发酵温度为32 ℃，高于模式菌株28 ℃的发酵温度。据报道，部分陆生Parengyodontiumalbum菌株可感染人体[25]，海洋来源的HX2019006菌株在低盐浓度下生长缓慢，具有较高的生物安全性；同时，较高的发酵温度有助于缩短发酵周期、减少发酵过程中降温能耗等[26]，ParengyodontiumalbumHX2019006作为蛋白酶生产菌具有进一步研究价值。

3 结论

从厦门市集美区海泥中筛选得到1株产蛋白酶的丝状真菌HX2019006，菌丝细小，产孢子。经提取ITS序列进行比对与建树，鉴定为ParengyodontiumalbumHX2019006。该菌株在海水培养基中可发酵产生蛋白酶，经单因素与响应面优化，其较优发酵培养基为麦芽糖26 g/L，蛋白胨9 g/L，酵母浸粉2 g/L，海水晶15 g/L，初始pH 7.5；较优发酵条件为接种量10%，250 mL三角瓶装液50 mL，32 ℃培养96 h；蛋白酶活力可达71.1 U/mL。该菌株与模式菌株ParengyodontiumalbumLimber生长及产蛋白酶条件存在存在显著差异，具有进一步研究的价值。