酶法水解杏鲍菇谷蛋白制备抗氧化肽

2020-10-22赵成萍耿正伟张咏梅史瑞婕冯翠萍

农产品加工 2020年17期

赵成萍，耿正伟，张咏梅，史瑞婕，冯翠萍

（1.山西农业大学生命科学院，山西晋中 030801；2.山西农业大学食品科学与工程学院，山西晋中 030801）

杏鲍菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹侧耳、刺芹菇，含有丰富的蛋白质、矿物质、碳水化合物和维生素，其中蛋白含量为12.4%～35.0%[1-3]，具有抗氧化和免疫调节等功能[4-6]，是理想的功能食品。研究表明，杏鲍菇蛋白含有清蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和谷蛋白4种蛋白，其中含量较多的为清蛋白和谷蛋白，分别占总蛋白含量的42.55%，30.71%，不同种类蛋白质结构不同、特性不同[7]。

多肽是一种由蛋白质经过酶分解而来的小分子物质，具有降血压、抗氧化、降胆固醇、降血糖等生理功能[8-14]。杏鲍菇作为一种优质蛋白质来源的食物，是多肽的重要资源，制备出的杏鲍菇多肽具有抗氧化和抑菌作用[15-17]，对铅致大鼠骨骼损伤和氧化损伤具有明显的缓解作用[18-20]。

目前，杏鲍菇多肽的制备所用到的原料主要为总蛋白，而杏鲍菇中不同种类蛋白水解产物的研究还鲜见报道。因此，以杏鲍菇谷蛋白为原料，通过酶解法制备杏鲍菇谷抗氧化肽，以期为开发杏鲍菇多肽类产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料

杏鲍菇，市售。

中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、酸性蛋白酶、风味蛋白酶均为食品级，河南圣斯德实业有限公司提供；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，美国Sigma公司提供；Tris、氢氧化钠、邻苯三酚、无水乙醇、三氯乙酸、氯化钠、水杨酸、硫酸亚铁、无水乙醇、H2O2、盐酸、铁氰化钾、磷酸二氢钠、碳酸氢二钠，均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器与设备

HH-2型电子恒温水浴锅，天津市赛得利斯实验分析仪器制造厂产品；ST3100型pH计、AR224CN型电子分析天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司产品；LD5-2B型离心机，北京雷勃尔医疗器械有限公司产品；UV-1200型紫外-可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 杏鲍菇谷蛋白的提取

以杏鲍菇为原料，在料液比1∶12，提取时间180 min，提取温度40℃，pH值12，在等电点pH值4.3时沉淀制得。

1.2.2 杏鲍菇谷抗氧化肽的制备流程

杏鲍菇谷蛋白溶液→调pH值→加蛋白酶酶解→灭酶→离心取上清液。

1.2.3 蛋白酶的筛选

按1.2.2的酶解工艺流程操作，选择碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶和酸性蛋白酶在各自最适水解条件下水解杏鲍菇谷蛋白。以酶解液的水解度、·OH清除率、O2-·清除率、DPPH·清除率、总还原力作为考查指标，筛选出合适的蛋白酶。

（1）水解杏鲍菇谷蛋白单酶的筛选。在确定每种蛋白酶酶用量的条件下，分别设定其在各自最适水解条件下水解杏鲍菇谷蛋白，以水解度和O2-·、·OH、DPPH·清除率，总还原力为指标，初步筛选出杏鲍菇谷蛋白酶解液抗氧化活性较强的蛋白酶。

（2）水解杏鲍菇谷蛋白双酶的筛选。通过单酶筛选出5种蛋白酶，设计出10种双酶组合水解的方式，蛋白酶种类出现顺序即分步水解法的加酶顺序。具体水解步骤如下：将杏鲍菇谷蛋白溶液调节至第一种蛋白酶水解的最佳条件，加酶反应一段时间后，放入100℃的水浴锅中灭酶，然后冷却，再将溶液调节至第2种蛋白酶水解的最佳条件后加入第2种蛋白酶，水解反应一段时间后，于100℃下灭酶。测定杏鲍菇谷蛋白水解产物对水解度、O2-·、·OH、DPPH·的清除率和总还原力的影响。

1.2.4 水解度的测定

采用pH-stat法。

1.2.5 抗氧化指标测定

（1） O2-·清除率。将1 mL不同质量浓度0.1，0.3，0.5，0.7，0.9 mg/mL的杏鲍菇谷蛋白酶解液分别放入试管中。各加入2 mL Tris-HCl缓冲液，然后将试管放入37℃的水浴锅中，加热一段时间后取出与邻苯三酚反应。于波长325 nm处每隔30 s记录1次OD值，持续4 min。△A为加入杏鲍菇酶解液后邻苯三酚的自氧化速率；△A0为未加杏鲍菇酶解液的邻苯三酚自氧化速率。每个试验重复3次。

（2）·OH清除率。取1 mL不同质量浓度0.1，0.3，0.5，0.7，0.9 mg/mL的杏鲍菇谷蛋白酶解液分别置于试管中；然后加入0.3 mL水杨酸溶液、1 mL FeSO4、0.7 mL H2O2，在匀浆机上混匀后，于37℃下恒温反应30 min，并于波长510 nm处测得OD值（A），（A0）以蒸馏水代替杏鲍菇酶解液。每个试验重复 3次。

（3） DPPH·清除率。分别取2 mL不同质量浓度0.1，0.3，0.5，0.7，0.9 mg/mL的杏鲍菇谷蛋白酶解液分别置于试管中，与2 mL的DPPH·无水甲醇溶液反应，避光条件下放置30 min，于波长510 nm处测定 OD值（A）。2 mL的 DPPH·无水甲醇溶液和2 mL蒸馏水混合作为对照组（A0）。用2 mL蒸馏水和2 mL无水甲醇调零。每个试验重复3次。

（4）总还原力。分别取2 mL不同质量浓度0.1，0.3，0.5，0.7，0.9 mg/mL的杏鲍菇谷蛋白酶解液置于试管中；加入2.5 mL浓度为0.2 mol/L（pH值6.6）的PBS和2 mL质量分数为1%的 K3[Fe(CN)6]，混匀后，于50℃下恒温反应20 min；再各加入2.5 mL质量分数为10%（W/V）的TCA，10 min后，以转速4 500 r/min离心20 min，然后取2.5 mL上清液、质量分数为0.1%FeCl30.5 mL和蒸馏水2 mL在试管中反应10 min，于波长700 nm处测定OD值。每个试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 水解杏鲍菇谷蛋白单酶的筛选

2.1.1 不同蛋白酶水解杏鲍菇谷蛋白的水解度

不同蛋白酶的水解度见图2。

图2 不同蛋白酶的水解度

由图2可知，在每种蛋白酶的最适条件下水解杏鲍菇谷蛋白，水解度最高的是碱性蛋白酶为61.22%，其次是风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶，其水解度分别为51.32%，50.62%，40.51%，34.91%，21.36%，水解度最低的为酸性蛋白酶，其水解度为4.56%。

2.1.2 不同蛋白酶水解杏鲍菇谷蛋白后对O2-·的清除率

图3 不同酶解产物对·的清除率

由图3可知，在试验质量浓度范围内，不同杏鲍菇谷蛋白酶解液对O2-·的清除率随着质量浓度的升高呈上升趋势，当溶液质量浓度为0.9 mg/mL时，不同蛋白酶解液的清除率由大到小依次为碱性蛋白酶70.19%＞木瓜蛋白酶68.22%＞中性蛋白酶59.10%＞胰蛋白酶54.63%＞风味蛋白酶53.76%＞菠萝蛋白酶37.55%＞酸性蛋白酶24.94%。

2.1.3 不同蛋白酶水解杏鲍菇谷蛋白后对·OH的清除率

不同酶解产物对·OH的清除率见图4。

由图4可知，在试验质量浓度范围内，不同杏鲍菇谷蛋白酶解液对·OH的清除率随着质量浓度的升高呈上升趋势，当溶液质量浓度为0.9 mg/mL时，不同蛋白酶解液的清除率由大到小依次为碱性蛋白酶74.47%＞中性蛋白酶71.32%＞木瓜蛋白酶68.58%＞风味蛋白酶63.15%＞胰蛋白酶50.11%＞菠萝蛋白酶31.72%＞酸性蛋白酶24.32%。

图4 不同酶解产物对·OH的清除率

2.1.4 不同蛋白酶水解杏鲍菇谷蛋白后对DPPH·的清除率

不同酶解产物对DPPH·的清除率见图5。

图5 不同酶解产物对DPPH·的清除率

由图5可知，在试验质量浓度范围内，不同杏鲍菇谷蛋白酶解液对DPPH·的清除率随着质量浓度的升高呈上升趋势，当溶液质量浓度为0.9 mg/mL时，不同蛋白酶解液的清除率由大到小依次为碱性蛋白酶74.21%＞木瓜蛋白酶68.49%＞中性蛋白酶66.62%＞风味蛋白酶56.76%＞胰蛋白酶49.62%＞菠萝蛋白酶35.24%＞酸性蛋白酶26.92%。

2.1.5 不同蛋白酶水解杏鲍菇谷蛋白后的总还原力

不同酶解产物的总还原力见图6。

图6 不同酶解产物的总还原力

由图6可知，在试验质量浓度范围内，不同杏鲍菇谷蛋白酶解液的总还原力随着质量浓度的升高呈上升趋势，当溶液质量浓度为0.9 mg/mL时，不同蛋白酶解液对总还原力的影响由大到小依次为碱性蛋白酶0.179＞中性蛋白酶0.146＞木瓜蛋白酶0.118＞胰蛋白酶0.112＞风味蛋白酶0.104＞菠萝蛋白酶0.094＞酸性蛋白酶0.059。

通过对7种蛋白酶水解杏鲍菇谷蛋白的水解度、O2-·清除率、·OH清除率、DPPH·清除率、总还原力结果的对比分析，可以看出碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶这5种蛋白酶酶解产物的抗氧化性较好，所以选择这5种蛋白酶进行下一步的双酶组合试验。

2.2 水解杏鲍菇谷蛋白双酶的筛选

将碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶5种蛋白酶按照1∶1的比例进行两两组合，在各自最佳条件下分步酶解杏鲍菇谷蛋白。

2.2.1 不同双酶组合水解杏鲍菇谷蛋白后的水解度

不同蛋白酶组合的水解度见图7。

图7 不同蛋白酶组合的水解度

由图7可知，杏鲍菇谷蛋白在不同蛋白酶两两组合水解的条件下，碱性蛋白酶与胰蛋白酶分步水解，其水解度最高为65.79%，其次是中性蛋白酶和风味蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶、风味蛋白酶和胰蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，水解度分别为62.48%，56.83%，54.98%，50.84%，48.54%，45.26%，44.72%，41.87%，最后是风味蛋白酶和木瓜蛋白酶，其水解度为39.99%。

2.2.2 不同双酶组合水解杏鲍菇谷蛋白后对O2-·的清除率

不同双酶组合酶解液对O2-·的清除率见图8。

图8 不同双酶组合酶解液对O2-·的清除率

由图8可知，在试验质量浓度范围内，不同双酶组合酶解液对O2-·的清除率随着质量浓度的升高呈上升趋势，当溶液质量浓度为0.9 mg/mL时，不同组合蛋白酶解液的清除率由大到小依次为中性蛋白酶和风味蛋白酶72.32%＞碱性蛋白酶和风味蛋白酶70.03%＞中性蛋白酶和胰蛋白酶68.97%＞木瓜蛋白酶和胰蛋白酶60.05%＞碱性蛋白酶和中性蛋白酶59.40%＞碱性蛋白酶和胰蛋白酶58.74%＞碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶56.45%＞中性蛋白酶和木瓜蛋白酶52.85%＞风味蛋白酶和胰蛋白酶50.83%＞木瓜蛋白酶和风味蛋白酶47.45%。

2.2.3 不同双酶组合水解杏鲍菇谷蛋白后对·OH的清除率

不同双酶组合酶解液对·OH的清除率见图9。

图9 不同双酶组合酶解液对·OH的清除率

由图9可知，在试验质量浓度范围内，不同双酶组合酶解液对·OH的清除率随着质量浓度的升高呈上升趋势，当溶液质量浓度为0.9 mg/mL时，不同双酶组合酶解液的清除率由大到小依次为中性蛋白酶和风味蛋白酶73.91%＞中性蛋白酶和胰蛋白酶69.44%＞碱性蛋白酶和风味蛋白酶63.13%＞风味蛋白酶和胰蛋白酶61.27%＞中性蛋白酶和木瓜蛋白酶57.38%＞碱性蛋白酶和中性蛋白酶54.39%＞木瓜蛋白酶和胰蛋白酶52.05%＞碱性蛋白酶和胰蛋白酶50.92%＞木瓜蛋白酶和风味蛋白酶49.17%＞碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶47.73%。

2.2.4 不同双酶组合水解杏鲍菇谷蛋白后对DPPH·的清除率

不同双酶组合酶解液对DPPH·清除率见图10。

图10 不同双酶组合酶解液对DPPH·清除率

由图10可知，在试验质量浓度范围内，不同双酶组合酶解液对DPPH·的清除率随着质量浓度的升高呈上升趋势，当溶液质量浓度为0.9 mg/mL时，不同蛋白酶解液清除率由大到小依次为中性蛋白酶和风味蛋白酶77.13%＞中性蛋白酶和胰蛋白酶74.98%＞碱性蛋白酶和风味蛋白酶71.44%＞碱性蛋白酶和中性蛋白酶66.84%＞碱性蛋白酶和胰蛋白酶62.23%＞木瓜蛋白酶和胰蛋白酶59.45%＞中性蛋白酶和木瓜蛋白酶53.79%＞碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶52.43%＞风味蛋白酶和胰蛋白酶44.10%＞木瓜蛋白酶和风味蛋白酶38.93%。

2.2.5 不同双酶组合水解杏鲍菇谷蛋白后的总还原力不同双酶组合酶解液的总还原力见图11。

由图11可知，在试验质量浓度范围内，不同双酶组合酶解液的总还原力随着质量浓度的升高呈上升趋势，当溶液质量浓度为0.9 mg/mL时，不同双酶组合酶解液对总还原力的影响由大到小依次为中性蛋白酶和风味蛋白酶0.219＞中性蛋白酶和胰蛋白酶0.193＞木瓜蛋白酶和胰蛋白酶0.173＞碱性蛋白酶和风味蛋白酶0.171＞碱性蛋白酶和胰蛋白酶0.166＞风味蛋白酶和胰蛋白酶0.164＞碱性蛋白酶和中性蛋白酶0.159＞中性蛋白酶和木瓜蛋白酶0.156＞碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶0.149＞木瓜蛋白酶和风味蛋白酶0.126。