刚地弓形虫RH株速殖子外泌体的分离与鉴定

凌薇， 宋玉洁， 汪慧， 朱昱蓉， 袁琳， 马雨润， 程芳， 姜旭淦， 陈盛霞

(江苏大学医学院， 江苏 镇江 212013)

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种可以感染所有温血动物的专性细胞内寄生虫，可引起人畜共患病弓形虫病[1-2]。全球约有三分之一的人口感染刚地弓形虫，大多数表现为隐性或无症状感染。弓形虫感染常导致人类和动物的先天性疾病和流产[3-4]。弓形虫病常为艾滋病患者或其他免疫力严重低下人群的并发症[2,5]。

外泌体(exsomes)是一种直径为30～150 nm的纳米级囊泡，通过多泡体与质膜融合而分泌到细胞外。这些小囊泡含有多种生物活性分子，包括蛋白质、脂质和核酸等，不仅具有免疫调节功能[6-7]，还在物质信息传递、细胞间通讯中起关键作用[8-9]。根据外泌体的来源和大小，已有5种外泌体分离技术，分别是超高速离心技术、基于尺寸的分离技术、聚合物沉淀技术、免疫亲和捕获技术和最近发展的微流体衍生技术，并在聚合物沉淀技术的基础上开发出更加成熟的外泌体提取试剂盒[10]。外泌体的特征可以通过其大小、蛋白质和脂质含量来描述，也可以通过检测其形态特征、粒径和表面标志来鉴别[11]。

研究发现，寄生虫的外泌体或微囊泡能够作用于宿主细胞，调控宿主细胞的基因表达和免疫反应，参与寄生虫致病过程[12]。其中，研究较多的有利什曼原虫、锥虫、恶性疟原虫和阴道毛滴虫等[7]；而对于弓形虫的研究相对较少[13]，并且弓形虫生活史复杂及虫株多样，给弓形虫外泌体研究造成了一定的困难。本研究探讨弓形虫RH株速殖子与细胞共培养条件下外泌体的分离和鉴定，为弓形虫外泌体的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 虫株、细胞株、主要试剂

弓形虫RH株速殖子和人结肠癌SW480细胞株由本课题组液氮保存。RPMI 1640培养基和胎牛血清(以色列BI公司)，CD63和HSP70抗体(美国Proteintech公司)，表面抗原1(surface antigen 1，SAG1)、棒状体蛋白16(rhoptry protein 16，ROP16)、ROP18、致密颗粒蛋白1(dense granule protein 1，GRA1)兔多克隆抗体由本课题组制备[14-17]，羊抗兔IgG二抗(武汉博士德生物工程有限公司)，RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂(上海碧云天生物技术有限公司)，0.22 μm滤器、ECL化学发光显色液和15 mL 100 000浓缩柱(美国Millipore公司)，外泌体提取试剂(美国System Biosciences公司)。

1.2 细胞培养及上清液收集

将胎牛血清经4 ℃、100 000×g离心16 h，收集上层1/3液体，并通过0.22 μm滤器过滤除菌，制备成除外泌体胎牛血清。常规复苏SW480细胞，用含有10%胎牛血清RPMI 1640培养基于T25培养瓶中常规培养SW480细胞，待细胞密度达到80%～90%时，吸弃培养液，PBS洗2次，加入含1%除外泌体胎牛血清RPMI 1640培养基，继续培养24 h，收集培养液(此为细胞培养上清液)，-80 ℃保存备用。

1.3 弓形虫与细胞共培养上清液及速殖子蛋白制备

常规复苏弓形虫RH株速殖子，参照文献[18]方法在SW480细胞中连续传代获得弓形虫速殖子；在T25细胞培养瓶中，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养SW480细胞，待细胞生长密度达到80%～90%时，吸弃培养液，换成含1%除外泌体胎牛血清培养基，接种5×106个弓形虫速殖子继续培养；每隔8 h于倒置显微镜下观察细胞和虫体生长情况；24 h可见虫体假包囊形成，3～4 d内细胞全部被胀破，速殖子游离在培养基中。收集此时的培养物， 3 200×g离心10 min，上清液即为弓形虫与细胞共培养上清液，-80 ℃保存备用。

在上述共培养沉淀中加入1×PBS重悬，300×g离心5 min，吸取上清液，再重复上述操作2次。上清液经3 200×g离心10 min，沉淀重悬于1×PBS中，冻融3次。加入蛋白裂解液(RIPA ∶PMSF=99 ∶1)，在冰上以60 W/s超声2 min，4 ℃、12 000×g离心30 min，收集上清液。用Bradford法测定蛋白含量，-80 ℃保存备用。

1.4 外泌体分离

将收集的弓形虫速殖子与细胞共培养上清液和细胞培养上清液于4 ℃下分别经300×g离心10 min，收集上清液，再经2 000×g离心20 min；继续收集上清液，经10 000×g离心30 min。吸取上清液，加入15 mL 100 000浓缩柱，4 ℃、1 000×g离心30 min，吸取浓缩液体；浓缩液通过0.22 μm滤器除菌，以5 ∶1比例加入外泌体提取试剂，4 ℃过夜；4 ℃、1 500×g离心30 min，管底可见淡黄色至白色沉淀，吸弃上清液；4 ℃、1 500×g再离心5 min，吸弃残留上清液，以1 ∶1比例加入1×PBS溶解沉淀(此为外泌体)，分装后-80 ℃保存。

1.5 透射电镜观察外泌体形态

用移液器吸取50 μL外泌体悬液于洁净载玻片上，将载样铜网倒扣于悬液上，注意区分铜网正反面，室温静置3 min，自然干燥；滴加2%磷钨酸复染3 min，滤纸吸干残留液，白炽灯下烤10 min，透射电镜观察拍照。

1.6 纳米粒子跟踪分析仪检测外泌体大小

用1×PBS缓冲液稀释分离的外泌体样品，使用ZetaView PMX 110仪器及其相应的ZetaView 8.04.02软件对稀释后的样本进行纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)以测量外泌体的粒径和浓度；实验中，在11个位置记录和分析NAT测量值，以110 nm聚苯乙烯颗粒校准ZataView系统，温度保持在23 ℃～27 ℃。

1.7 蛋白质印迹法检测外泌体标志蛋白和弓形虫特异蛋白

将外泌体样本、弓形虫蛋白样本分别与上样缓冲液混匀，100 ℃水中煮10 min备用。样本分别用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，以80 V恒压电泳120 min，300 mA恒流转印90 min，使蛋白转至预先经甲醇活化的PVDF膜上。用含5%的脱脂奶粉TBST室温封闭2 h，分别加入CD63抗体(1 ∶500)、HSP70抗体(1 ∶500)、SAG1抗体(1 ∶100)、ROP16抗体(1 ∶100)、ROP18抗体(1 ∶100)、GRA1抗体(1 ∶100)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入相应的二抗(1 ∶1 000)，室温孵育1 h，洗膜3次，加ECL化学发光试剂显色并拍照。

2 结果

2.1 弓形虫外泌体超微结构

透射电镜结果显示，弓形虫外泌体呈圆形或椭圆形的囊泡样，囊泡外周可见膜性结构，大小具有异质性，直径为30～150 nm，腔内部显示低电子密度成分，背景清晰，无污染(图1)。

图1 弓形虫外泌体透射电镜观察

2.2 弓形虫外泌体粒径分析结果

分离获得的外泌体3 000倍稀释，利用NTA技术检测外泌体的粒径大小。结果显示，弓形虫外泌体平均粒径大小为119.5 nm(图2A)；直径大多在30～150 nm，占总数的87.8%(图2B)。

A：外泌体粒径大小分布；B：外泌体粒径大小百分比

图2 弓形虫外泌体纳米粒径分析

2.3 蛋白质印迹结果

弓形虫外泌体与SW480细胞外泌体均有CD63和HSP70蛋白的表达(图3A)。弓形虫分泌蛋白SAG1、ROP16、ROP18、GRA1检测结果显示，弓形虫外泌体与弓形虫速殖子中均有这些蛋白表达，而在SW480细胞外泌体中却未检测到(图3B)。

A：外泌体标志蛋白；B：弓形虫特异蛋白图3 弓形虫外泌体标志蛋白和弓形虫特异蛋白分析

3 讨论

有研究报道采用体外单独培养方法，收集弓形虫培养上清液，可分离弓形虫速殖子外泌体[13, 19]。本研究早期也采用这个方法，但分离的外泌体浓度低，原因可能是经3 μm滤膜纯化时，速殖子受外力挤压、破坏，离开细胞时间过长，虫体活力降低，外泌体的分泌减少。本研究用虫体与细胞共培养[20]，收集从虫体侵入细胞开始到细胞破裂、虫体游离整个过程的培养上清液，虫体增殖旺盛，分泌较多外泌体；而且这种方法更接近虫体与宿主细胞作用的自然状态，后续研究更能揭示虫体外泌体的真实作用。尽管分离的外泌体中存在少量细胞分泌的外泌体，但在后续实验中，以细胞培养上清液分离的外泌体作为对照，即可消除共培养细胞外泌体的干扰作用。

外泌体分离方法中最常用的是试剂盒法和超速离心法。超速离心法是经典分离方法，是分离外泌体的金标准[21]，操作简单，适合大体积样本的分离，不适用于微量及珍贵样本的研究。Linares等[22]报道，超速离心会造成外泌体损失，使外泌体易聚集，降低外泌体的质量及产量，破坏囊泡的完整性，进而影响下游分析。试剂盒法是基于聚合物沉淀技术、实现外泌体快速分离纯化的分离方法，操作简单，无需特殊的技术及设备。Tang等[23]报道，与超速离心法相比，试剂盒法分离的外泌体回收率更高，可用于下游分析试验，但其易受其他非外泌体污染，导致外泌体纯度降低。本研究在试剂盒法的基础上，通过多次离心、浓缩、过滤等操作，成功从细胞与速殖子共培养上清液中分离出外泌体，从而保证了后续实验的进行。

本研究根据Li等[13]报道的弓形虫外泌体鉴定方法，通过透射电镜、NTA及蛋白质印迹技术对分离的外泌体超微结构、粒径大小、表面标志进行鉴定。实验结果表明，分离的外泌体呈圆形或椭圆形的囊泡样，囊泡外周可见膜性结构，粒径范围为30～150 nm，含有外泌体表面标志蛋白CD63、HSP70和弓形虫特异蛋白SAG1蛋白，从而确定弓形虫外泌体分离成功。Li等[13, 24]研究发现，弓形虫释放的外泌体能够激活巨噬细胞，刺激促炎因子分泌，触发宿主免疫反应，对弓形虫感染有局部保护作用。本研究尝试检测速殖子其他重要蛋白，结果显示弓形虫外泌体含有虫体分泌蛋白ROP16、ROP18、GRA1。这些蛋白是由弓形虫速殖子细胞器(如棒状体、致密颗粒和微线体等)分泌，在弓形虫入侵宿主细胞过程中发挥重要作用。这些蛋白的检出表明，外泌体可能作为弓形虫分泌蛋白排出细胞的一种途径，参与弓形虫的致病、免疫调节等过程。因此，进一步研究弓形虫外泌体的蛋白或酶等其他组分，分析其在弓形虫感染中的作用，可为弓形虫与宿主相互作用及其机制的研究提供新思路。