APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ斑块沉积增多下调CA3和CA1区域神经元及细胞增殖导致学习和记忆损害

刘婉晴，刘 航,杨婧艺，马 英

0 引言

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是最常见的一种痴呆类型，约占痴呆病例的70%[1]。AD典型临床症状是认知功能障碍中所包含的记忆能力进行性下降，神经病理学标志是在脑组织神经元细胞外出现β淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成的神经炎性淀粉斑块、tau蛋白异常磷酸化所形成的神经原纤维缠结，而Aβ沉积可引起脑实质的损伤，可能与学习、记忆和认知功能障碍过程中神经元丢失有关[2]。神经再生是神经干细胞产生神经元的过程,包括4个阶段：神经干细胞的增殖、分化、存活以及成熟[3]。有研究发现,Aβ沉积的AD转基因小鼠其海马区神经元的丢失可以引起学习和记忆能力的损害[4]。脑成像显示,在AD的发展过程中，海马最易受到影响，萎缩程度最为明显[5]。因此，AD发生的根本原因在于海马受到了损害。海马位于大脑颞叶中的双侧结构，不同区域的功能也不同，其中CA3和CA1区域在学习和记忆中担任重要作用[6]。有报道，AD海马CA3和CA1区域神经元丢失导致锥体层萎缩[7]，也有研究发现，在AD大鼠海马CA1和CA3区域显示出神经元数目增加[8]。本研究主要目的是检测AD小鼠脑内Aβ斑块沉积增多对CA3和CA1区域神经元以及细胞增殖的影响，并探讨其损伤学习及记忆能力的机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型与分组 将雄性12月龄小鼠(均在中国医科大学动物部购买)分为2组：APP/PS1小鼠5只作为实验组(AD组)，是表达嵌合小鼠/人淀粉样前体蛋白(Mo/HuApp695swe)和突变型人早老蛋白(PS1)的Tg小鼠，Mo/HuApp695swe可使小鼠产生人类的Aβ沉积；C57BL/6J 野生型小鼠5只作为对照组(C57组)。在实验前至少10 d将小鼠转移到动物实验室以适应环境，在标准条件[12 h光照/黑暗循环，温度(21±2)℃]下饲养动物，使其自由获取食物和水。

1.2 水迷宫实验 检测小鼠行为学变化，采用Morris水迷宫恒温游泳池(淮北正华生物仪器设备有限公司)测试小鼠空间记忆能力，试验在装有23～26 ℃温水的圆形水池中进行，水池直径为160 cm，深70 cm，水深40 cm，分为4个象限，一个9 cm×9 cm圆形平台置于第4象限水平面下1 cm，摄像机位于水平面上方170 cm处，实验一共为6 d，前5.5 d为学习训练，最后1 d下午开始进行测试。迷宫分析软件记录小鼠游泳总路程、第4象限活动时间、站台穿越次数和周边活动时间等数据,以分析小鼠学习和记忆能力。水迷宫实验结束后多聚甲醛灌注，收集12月龄小鼠脑组织，随后石蜡包埋。

1.3 取材 在小鼠进行水迷宫检测后，麻醉，200 ml 4%多聚甲醛灌注后获得大脑，放置在70%乙醇内，随后用二甲苯处理，石蜡包埋，随后用于免疫组织化学检测。

1.4 免疫组化检测海马及皮质Aβ斑块沉积 将两组小鼠石蜡包埋的脑组织置于切片机上，获得厚度为5 mm的连续冠状切片，间隔为200 mm,将切下的组织置于载玻片上；进行常规脱蜡，抗原修复，然后磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次；为阻断内源性过氧化物酶活性，将载玻片置于3%双氧水中，并在室温下孵育20 min，PBS冲洗；滴加山羊血清(1∶10，Solarbio，#SL038),37 ℃孵育30 min；然后在切片上滴加兔抗β淀粉样蛋白抗体(1∶400，Cell Signaling Technology，#9888S)放入4 ℃孵育过夜；室温复温30 min，PBS冲洗3次；加入二抗工作液：辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶200，Solarbio，#SE134)，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次；用二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒显色，苏木素复染、盐酸酒精分化、脱水封片。通过连接至光学显微镜的相机捕获图像，使用Image J软件计数每只小鼠切片中×20显微镜获取的海马和皮质中Aβ斑块沉积的百分比。

1.5 免疫组化检测CA3以及CA1区域NeuN、ki-67表达 将石蜡包埋的两组小鼠脑组织置于切片机上，得厚度为5 mm的连续冠状切片，置于载玻片上。常规脱蜡后进行抗原修复，室温下用3%双氧水处理切片以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗后孵育一抗：鼠抗NeuN(1∶100，Millipore，America，#MAB377)，鼠抗ki-67(1∶200，abbkine，America，#ABM40064)；4 ℃孵育过夜，PBS常规冲洗继而加入二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(1∶200，Solarbio，China，#SE131),DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，脱水封片。通过显微镜相机捕获图像，使用Image J软件计数每只小鼠切片中×40显微镜获取的海马CA3、CA1区域的NeuN阳性细胞百分比以及ki-67阳性细胞百分比。

2 结果

2.1 两组小鼠的学习和记忆能力比较 两组小鼠总路程(图1A,F=0.788，P<0.05)、第4象限活动时间(图1B,F=2.333，P<0.05)、站台穿越次数(图1C,F=0.025，P<0.05)、周围活动时间比较差异有统计学意义(图1D,F=1.507，P=0.05)；与C57组小鼠相比，AD组小鼠的行为学测试显示，学习和记忆能力明显损害。

图1 两组小鼠学习及记忆能力比较

2.2 两组小鼠海马及皮质Aβ斑块密集沉积比较 AD组小鼠Aβ斑块主要分布在海马以及皮质区域，呈深棕色，与C57组比较分布更为密集。计数两组小鼠海马与皮质Aβ斑块沉积数量，结果显示，在海马区，AD组斑块沉积数百分比为(5.019%±1.457%)，而C57组为(0.176%±0.079%)；在皮质区，AD组斑块沉积数百分比为(7.429%±2.002%)，而C57组为(0.571%±0.159%)。两组比较差异有统计学意义(F=14.073,P<0.05；F=7.761，P<0.05)。见图2。

2.3 两组小鼠CA3和CA1区NeuN阳性细胞及ki-67阳性细胞表达比较 NeuN是成熟神经元特异性标记物，检测NeuN阳性细胞数可以评估CA3、CA1区神经元密度。图3显示，与C57组小鼠相比，AD组小鼠CA3和CA1区NeuN阳性细胞数量减少，AD小鼠CA3和CA1区域NeuN阳性细胞百分比分别为(4.769%±1.038%)、(5.029%±1.176%)，C57小鼠CA3和CA1区域NeuN阳性细胞百分比为(16.161%±1.516%)、(13.121%±2.356%)(F=2.209,P<0.05；F=4.160，P<0.05)，提示AD组小鼠CA3、CA1区神经元丢失较C57组严重。

Ki-67是细胞增殖标记物，检测ki-67阳性细胞数评估CA3、CA1区细胞增殖能力。图4显示，与C57组小鼠相比，AD组小鼠CA3和CA1区ki-67阳性细胞数量下降，AD小鼠CA3和CA1区域ki-67阳性细胞百分比分别为(4.872±1.029)%、(4.150±1.239)%，C57小鼠CA3和CA1区域ki-67阳性细胞百分比为(10.551±2.004)%、(8.354±1.458)%(F=3.656，P<0.05；F=0.005，P<0.05),提示AD组小鼠较C57组小鼠CA3、CA1区细胞增殖能力下降。

图2 两组小鼠海马及皮质Aβ斑块密集分布比较

图3 两组小鼠CA3和CA1区NeuN阳性细胞表达比较

图4 两组小鼠CA3和CA1区ki-67阳性细胞表达比较

3 讨论

大脑中的Aβ是由淀粉样前体蛋白(APP)经β-淀粉酶和γ-分泌酶的连续切割产生。β-分泌酶切割生成APP片段和C99肽，C99肽继而再由γ-分泌酶切割产生Aβ[9]。Aβ1-42和Aβ1-40是Aβ中最常见的亚型，在脑脊液和血浆中，Aβ1-40是Aβ1-42的10倍和1.5倍。Aβ1-42是AD病理学中的关键因素，能够形成Aβ斑块沉积的核心。此外，Aβ1-42具有神经毒性，因此，大脑中的Aβ沉积是AD发病机制的早期毒性事件[10-11]。本研究的Aβ斑块沉积及行为学检测提示，12月龄AD转基因小鼠较同月龄C57正常小鼠，Aβ斑块沉积在海马及皮质区域密集分布，并且小鼠的空间学习及记忆能力明显受损。这与Wirths[12]的实验结果相似，12～14月龄APP转基因小鼠的神经病理学显示，海马中存在大量的淀粉样沉积物，小鼠学习和记忆能力受损。Unger等[2]的研究结果也发现这一现象，Aβ斑块沉积在4月龄APP/PS1转基因小鼠海马中就可以检测到,随着月龄的增长，海马以及皮质中斑块负荷显著增加。我们既往研究发现，Aβ质粒免疫治疗可以促进Aβ清除，减轻神经炎症反应，从而缓解小鼠的空间学习和记忆损害[13]，以上研究提示，Aβ斑块沉积的增多可以引起AD小鼠空间学习和记忆损害。

Aβ沉积可以引起脑实质的损伤，影响最为显著的是海马等与智能有关的区域，从而引起学习和记忆障碍[14]。海马DG、CA3和CA1紧密聚集的神经元构成单向神经回路，研究报道，神经退行性疾病过程中CA3、CA1区域与学习记忆功能息息相关[15]。在海马注射Aβ1-42可引起CA3区广泛的神经元变性，表现为CA3中神经元丢失及核收缩，神经元丢失导致AD小鼠脑中学习和记忆能力受损，因此，控制神经元丢失可能是延迟甚至逆转AD发展的潜在疗法[16]。Padurariu等[17]的研究证实，与年龄相匹配的对照组相比，AD患者海马区神经元密度显著降低，尤其是在CA3和CA1区域。在APP/PS1转基因小鼠的研究中发现，早期即出现神经元选择性丢失，而Aβ是引起神经元丢失的主要因素[18]。本研究表明，AD小鼠Aβ的沉积增多促进小鼠CA3和CA1神经元丢失，进而导致小鼠学习和记忆能力受损。导致神经元丢失的原因存在争议，体外实验证明，Aβ促进细胞外Ca2+内流，增加细胞对氧化应激和兴奋性毒性的易感性，从而加剧细胞死亡[19]。Aβ斑块具有毒性，可减少乙酰胆碱(Ach)的合成，合成受阻后导致神经元功能减退或者死亡[20]，也有研究报道，在AD小鼠脑内，Aβ的沉积使星型胶质细胞被激活，产生神经炎症，使神经元数目显著丢失。

在成年期，神经再生主要发生在以下2个区域：海马齿状回的颗粒下层和侧脑室的室管膜下区，但是也不排除其他区域依旧存在神经再生情况[21]。增殖的神经干细胞(NSCs)(表达ki-67)分化为中间前体细胞D，D细胞迁移为成神经细胞，经历4～8周，其生理学和解剖学接近完全成熟的神经元(表达NeuN)，接收来自内嗅皮层的信息并投射到CA3区域，进一步传递到CA1区域，神经再生过程增加了海马回路的可塑性以及复杂性[22-23]。Zeng等[24]在APP/PS1/Nestin-GFP三重转基因小鼠与正常小鼠比较的研究中发现，转基因小鼠神经干细胞数目减少，未成熟神经元的存活率下降。并且还有研究提示，APP/PS1转基因小鼠神经再生下调，其神经干细胞增殖下降，神经元减少导致小鼠学习和记忆障碍[25]。但是Jin等[26]发现，AD患者的海马组织与非AD患者的海马组织比较，AD患者海马区成熟神经元的存活数目有所增加，海马区神经再生上调，上调原因可能是因为机体的一种内源性代偿机制，在病理条件下开启对认知障碍的保护[27]，但是随着时间的推移，这种代偿机制是否可以一直持续,尚不明确，有待于进一步研究不同时期的变化。有研究显示，AD患者海马的CA1区域ki-67阳性细胞数目增加[28]，而本研究中ki-67数目减少，原因可能是检测ki-67的时间阶段不一致。当神经炎症加剧时，增殖细胞数目可能增加，并且其大部分增殖的细胞可能分化为胶质细胞，随后神经干细胞增殖能力远远低于正常小鼠，ki-67将会迅速下降。本实验研究检测CA3、CA1区域ki-67阳性细胞的表达，与C57组正常小鼠相比，AD小鼠ki-67阳性细胞数目下降，提示AD小鼠神经干细胞增殖能力下降，这也可能是相同区域NeuN阳性细胞代表的神经元数目减少的重要原因。神经元丢失是导致AD小鼠脑中学习和记忆受损的不可逆的过程，因此，操控神经再生以补偿神经元丢失可能是延迟甚至逆转AD进展的潜在疗法。

综上所述，与同月龄的C57正常小鼠相比，12月龄AD小鼠脑内有大量的Aβ斑块沉积，并且海马亚区CA3、CA1区出现神经元丢失明显及细胞增殖能力下降，提示下调此区域的神经再生，可导致小鼠学习和记忆能力明显损害。但是针对Aβ斑块沉积引发的神经元丢失及神经再生下降的机制尚不明确，是以后研究的方向，调节神经再生将成为缓解甚至逆转AD的崭新治疗靶点。