阿仑膦酸钠通过调控NF-κB和MAPK信号通路改善大鼠骨质疏松的发展

沈云玲，魏 静，徐小宇

0 引言

随着人口老龄化的增长，骨质疏松症(Osteoporosis，OP)已成为重要的公共卫生问题，影响着数百万人的日常活动和生活质量，为患者带来了严重的经济负担[1]。因此，深入研究骨质疏松症的发生机制和防治措施对于提高患者的生活质量和降低死亡率具有重要意义。

骨重塑是调节骨结构和功能的主要代谢过程，主要与破骨细胞介导的骨吸收过程和成骨细胞介导的骨形成过程相关[2]。异常情况下，破骨细胞介导的骨吸收活性增强将导致骨代谢性疾病的发生，如骨质疏松症[3]。核因子(NF)-κB作为一种重要的细胞内转录因子，其对于成骨细胞和破骨细胞的分化形成具有重要意义[4]。除此之外，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路是细胞内的重要信号转导通路，参与介导细胞的生长、分化及发育等多种过程，其通过调控成骨细胞和破骨细胞的分化及增殖参与骨质疏松症的发生和发展[5]。阿仑膦酸钠是一种骨吸收抑制剂，其能够通过诱导破骨细胞凋亡抑制骨吸收过程，广泛应用于骨质疏松症的治疗，但是其抗骨质疏松症的作用机制尚不明确[6]。因此，本研究采用骨质疏松大鼠模型探讨了阿仑膦酸钠对骨质疏松症的作用及相关分子机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料 p-p65、p65、p-p50、p50、p-JNK、p-p38、p-ERK及GAPDH抗体(CST，美国)；HRP标记山羊抗兔IG(Abcam，中国)；RIPA蛋白裂解液(中)、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂(碧云天，中国)；阿仑膦酸钠片(扬子江药业集团，中国)；氨苄青霉素(威仕特，加拿大)；苏木精-伊红染色液(碧云天，中国)；钙、磷、E2、IL-6及IL-1β大鼠ELISA试剂盒(联科，中国)。

1.2 动物分组及给药 所有动物实验均通过动物伦理委员会的同意和批准，将50只雌性SD大鼠[(250±5)g]随机分为假手术组、模型组及阿仑膦酸钠组(ALN-25 μg/kg、ALN-50 μg/kg和ALN-100 μg/kg)，每组10只，术后8周开始灌胃给药ALN，每天1次，连续8周，假手术组和模型组均灌胃给予等体积的生理盐水。

1.3 骨质疏松大鼠模型的建立 采用双侧卵巢切除法建立骨质疏松大鼠模型，造模前，大鼠禁食12 h，在第0周，腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，从大鼠背部脊柱两侧，分离并切除双侧卵巢；假手术组仅切除卵巢附近的脂肪组织，术后缝合伤口，计手术当周为第0周，连续肌肉注射4 d抗生素(氨苄青霉素，4×104U/d)。

1.4 骨密度(BMD)检测 在第16周给药结束后，腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉大鼠，平放于双能X线吸收测量仪上，测量大鼠全身的骨密度(g/cm2)。

1.5 血液指标检测 采用ELISA法检测大鼠血清中钙、磷、E2、IL-6及IL-1β的分泌水平，在第16周给药结束后，大鼠眼球取血，用1.5 ml EP管收集，4 ℃静置30 min，3 000 r/min离心10 min，吸取上清立即检测或置于-80 ℃保存。

1.6 HE病理染色 在第16周给药结束后，大鼠脱颈椎处死，分离收集实验大鼠的股骨组织，置于4%多聚甲醛固定24 h，然后用EDTA脱钙液(10%，pH 8.0)脱钙15 d，每3天更换1次，石蜡包埋，切成4 μm薄片，苏木精-伊红染色，观察病理变化。

1.7 Micro-CT 分离大鼠的股骨组织，固定于4%多聚甲醛中，并且使用Micro-PET/CT扫描仪(Inveon，Siemens，Berlin，Germany)分析远端股骨，扫描仪的分辨率为10 μm，管电压为50 kV，管电流为400 μA。

1.8 蛋白印迹免疫分析(Western blot) 大鼠脱颈椎处死，分离收集实验大鼠的股骨组织，称取约50 mg，采用Western blot检测大鼠股骨组织中p-p65、p65、p-p50、p50、p-JNK、p-p38、p-ERK的蛋白表达水平。根据说明书操作提取组织总蛋白，采用BCA法(碧云天，中国)对蛋白进行定量，加入Loading buffer(4×)于100 ℃煮沸5 min，然后进行SDS-PAGE电泳来达到分离蛋白的目的，电泳条件：80 V，30 min；120 V，60 min。随后采用100 V，90 min，将电泳分离后的蛋白转移至聚偏佛乙烯(PVDF)膜(Millipore，美国)，用5%脱脂奶粉封闭60 min，TBST洗涤5次，5 min/次，用一抗(p-p65、p65、p-p50、p50、p-JNK、p-p38、p-ERK及GAPDH，按1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜，TBST洗涤5次，5 min/次，用二抗(HRP标记山羊抗兔IG，按1∶10 000稀释)孵育90 min，TBST洗涤5次，5 min/次。用ECL化学发光法(Millipore，MA)显影检测，Image J分析灰度值，GAPDH用作内参对照。

2 结果

2.1 阿仑膦酸钠对骨质疏松大鼠骨密度(BMD)的影响 骨密度检测结果表明，与假手术组相比，模型组大鼠的骨密度值显著降低(P<0.01)；与模型组相比，25、50、100 μg/kg剂量的阿仑膦酸钠组大鼠的骨密度值显著增加(P<0.05)。表明本研究成功建立了骨质疏松大鼠模型，阿仑膦酸钠对骨质疏松症具有一定的缓解作用。见图1。

图1 阿仑膦酸钠对骨质疏松大鼠骨密度的影响

2.2 阿仑膦酸钠对骨质疏松大鼠骨代谢相关血液学指标的影响 采用ELISA法检测骨质疏松大鼠骨代谢相关的血液学指标变化，结果表明，与假手术组相比，模型组大鼠血清中钙、磷的水平显著下调(P<0.05)；灌胃给予阿仑膦酸钠呈剂量依赖性上调骨质疏松大鼠血清中钙、磷的水平(P<0.01或P<0.05)。见图2A。与假手术组相比，模型组大鼠血清中E2的水平显著下调(P<0.01)，IL-1β及IL-6的水平显著上调(P<0.01)；与模型组相比，灌胃给予阿仑膦酸钠呈剂量依赖性上调骨质疏松大鼠血清中E2的水平(P<0.05)，下调IL-1β、IL-6的水平(P<0.05)。见图2B。

2.3 阿仑膦酸钠对骨质疏松大鼠股骨结构变化的影响 采用HE染色和Micro-CT检测骨质疏松大鼠股骨结构的变化。HE染色结果表明，与对照组相比，模型组大鼠的股骨结构出现骨丢失；与模型组相比，灌胃给予阿仑膦酸钠呈剂量依赖性改善骨质疏松大鼠的股骨结构(图3A)。Micro-CT结果表明，与对照组相比，模型组大鼠股骨组织中骨小梁出现缺失；与模型组相比，灌胃给予阿仑膦酸钠呈剂量依赖性改善骨质疏松大鼠股骨的骨小梁结构(图3B)。

图2 阿仑膦酸钠对骨质疏松大鼠骨代谢相关血液学指标的影响

注：A.骨质疏松大鼠血清中钙、磷的水平；B.骨质疏松大鼠血清中E2、IL-1β、IL-6的水平。与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组比较，##P<0.01

2.4 阿仑膦酸钠对骨质疏松大鼠股骨组织中NF-κB信号通路活化的影响 采用Western blot法检测骨质疏松大鼠股骨组织中NF-κB通路相关分子的蛋白表达水平，结果表明,与假手术组相比，模型组大鼠股骨组织中p-p50/p50、p-p65/p65的表达水平上调(P<0.01)；与模型组相比，给予阿仑膦酸钠呈剂量依赖性下调骨质疏松大鼠股骨组织中p-p50/p50、p-p65/p65的表达水平(P<0.05)。见图4。

2.5 阿仑膦酸钠对骨质疏松大鼠股骨组织中MAPK信号通路活化的影响 采用Western blot法检测骨质疏松大鼠股骨组织中MAPK信号通路相关分子的蛋白表达水平。结果表明,与假手术组相比，模型组大鼠股骨组织中p-JNK、p-p38及p-ERK的表达水平显著上调(P<0.01)；与模型组相比，给予阿仑膦酸钠呈剂量依赖性下调骨质疏松大鼠股骨组织中p-JNK、p-p38及p-ERK的表达水平(P<0.05)。见图5。

图3 阿仑膦酸钠对骨质疏松大鼠股骨结构变化的影响

图4 阿仑膦酸钠对骨质疏松大鼠股骨组织中NF-κB信号通路的影响

3 讨论

骨质疏松症是一种常见的骨代谢性疾病，发病率和致残率较高，影响着全世界数百万人的生活质量[7]。阿仑膦酸钠是一种骨吸收抑制剂，应用于骨质疏松症的治疗。研究表明，高剂量的阿仑膦酸钠能够诱导破骨细胞的凋亡，从而产生抗骨质疏松的作用[6]，但是阿仑膦酸钠抗骨质疏松的具体作用机制仍不明确。因此，本研究采用骨质疏松大鼠模型，探索阿仑膦酸钠是否通过NF-κB和MAPK通路产生抗骨质疏松作用。

骨重塑是一个动态的骨代谢过程，在成年人骨骼的调节过程中起着至关重要的作用，其主要由破骨细胞介导的骨吸收过程和成骨细胞介导的骨形成过程维持，当平衡倾向于骨吸收过程时，将会导致骨流失，最终导致骨代谢相关疾病的发生，如骨质疏松症[5,8-9]。研究表明，骨质疏松大鼠血清中钙、磷水平与骨质疏松症的严重程度密切相关，除此之外，骨质疏松大鼠血清中雌激素(E2)水平会显著下调[10-12]。本研究结果表明，模型组大鼠血清中钙、磷及E2水平显著下降，与上述报道结果一致。同时，本研究结果表明，给予阿仑膦酸钠能够上调骨质疏松大鼠血清的钙、磷及E2水平。IL-1β和IL-6作为重要的细胞炎症因子，在破骨细胞介导的骨吸收过程中起着重要的作用。研究表明，骨质疏松症大鼠血清中IL-1β和IL-6水平显著上调[13]，这与本研究结果一致。同时，本研究结果表明，阿仑膦酸钠能够显著下调骨质疏松大鼠血清中IL-1β和IL-6的水平，表明阿仑膦酸钠能够通过改善骨代谢相关血液学指标缓解骨质疏松症的发展。

图5 阿仑膦酸钠对骨质疏松大鼠股骨组织中MAPK信号通路的影响

为了进一步探索阿仑膦酸钠的抗骨质疏松作用，本研究采用HE染色和Micro-CT观察股骨结构的变化。HE染色结果表明，模型组大鼠的股骨结构出现骨丢失，给予阿仑膦酸钠能够改善骨质疏松大鼠的股骨结构，防止骨丢失。Micro-CT结果表明，模型组大鼠股骨组织中骨小梁出现大面积缺失，灌胃给予阿仑膦酸钠呈剂量依赖性改善骨小梁骨丢失，上述结果表明，阿仑膦酸钠能够改善骨质疏松大鼠的骨结构。

NF-κB信号通路对于破骨细胞的形成和活化至关重要，在骨质疏松症的发展过程中具有关键性作用[14]。正常情况下，p65或p50与IκBα形成共聚体存在于细胞质中，当受到细胞外信号的刺激(如RNAKL、LPS)，IκBα发生磷酸化并降解，p65或p50进入细胞核，促进破骨细胞形成和活化相关信号分子的转录，促进破骨细胞的形成和活化[15]。本研究结果表明，灌胃给予阿仑膦酸钠能够抑制骨质疏松大鼠股骨组织中p-p65/p65和p-p50/p50的表达，进而抑制NF-κB信号通路。此外，MAPK信号通路是生物体内重要的信号转导通路，其亚族主要包括JNK、ERK及p38，参与介导细胞的生长、分化及发育等多种过程[16]。研究表明，MAPK信号通路对于破骨细胞的形成和活化具有重要作用，并且其也能够通过影响NF-κB信号通路介导骨质疏松症的发展[17-18]。本研究结果表明，灌胃给予阿仑膦酸钠能够下调骨质疏松大鼠股骨组织中磷酸化JNK、ERK及p38的表达，进而抑制MAPK信号通路活化，上述结果表明，阿仑膦酸钠能够抑制骨质疏松大鼠股骨组织中NF-κB和MAPK信号通路的活化。

综上所述，阿仑膦酸钠灌胃给予骨质疏松大鼠，能够通过调控NF-κB和MAPK信号通路的活化来缓解骨质疏松症的发展。因此，本研究为阿仑膦酸钠的抗骨质疏松作用机制研究提供了一定的参考方向。