下调miR-346表达增强奥沙利铂对结肠癌SW620细胞杀伤作用

闫晓菲，杨世华，李晓曦，石 刚*，张 睿

0 引言

结直肠癌发现时约有30%为晚期，表现为肝转移、肺转移、腹腔转移或局部晚期[1]，随着手术技术的发展，更有效的化疗药、靶向药及免疫治疗的深入，晚期结直肠癌生存率有所改善，但治愈手段仍然是手术，手术无法根治的患者治疗以化疗为基础的靶向治疗或免疫治疗等综合方案为主[2]。对靶基因进行上调或下调是目前结直肠晚期肿瘤药物研发的热点。结直肠癌化疗中，由于奥沙利铂(Oxaliplatin，OHP)的引入，晚期结直肠癌的生存期得到一定程度提高，其靶作用部位为DNA，铂原子可以与DNA交叉联结，对DNA复制和转录进行拮抗，对氟尿嘧啶的作用进行协同[3]。靶向药对化疗具有协同增效的作用[4]。前期研究显示，miR-346在结肠癌组织及细胞中表达高于正常结肠组织及上皮细胞，miR-346 mimics促进结肠癌细胞增殖，miR-346 inhibitor抑制结肠癌细胞增殖，因此，miR-346可能作为影响结肠癌细胞增殖及凋亡的靶基因[5-6]。本研究对miR-346在奥沙利铂诱导的结肠癌细胞增殖及凋亡进行检测，并检测了凋亡相关蛋白的变化，目的在于通过细胞实验观察miR-346可能作为奥沙利铂增效靶基因的可能，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞为SW620人结肠腺癌细胞株，购自中国医学科学院上海细胞库，培养方式为L-15细胞培养基(含有10%胎牛血清)，所有实验均进行3次重复。miR-346 mimics及miR-346 inhibitor购自美国INVITROGEN公司，抗体caspase-9及抗体Apaf-1购自美国Sigma公司，抗体Bcl-2及抗体Bax购自上海康城生物公司，奥沙利铂标准品(CAS号：61825-94-3)购自武汉睿辰标物科技有限公司，BCA蛋白定量试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，流式细胞检测试剂盒及MTT试剂盒购自美国Santa-Cruz公司。DAPI染色液购自日本TAKARA公司。

1.2 研究方法

1.2.1 转染 SW620细胞根据给予干预不同分为miR-346 mimic组、miR-346 inhibitor组、MOCK组、OHP组及OHP+miR-346 inhibitor组，选取对数期生长的细胞进行实验，首先在转染前24 h将细胞消化为单细胞悬液，接种到24孔板，融合度75%以上的SW620细胞可以进行转染miR-346 mimic或miR-346 inhibitor，操作按试剂盒说明书进行，转染后的细胞继续进行培养，OHP组及OHP+miR-346给予不同浓度或不同培养时间的OHP进行干预。Western blot及qRT-PCR检测MOCK组的转染效率。

1.2.2 MTT(Methyl-thiazolyl-tetrazolium)检测细胞增殖率或存活率 取对数生长期的各组SW620细胞，以密度为4×104/ml细胞接种到96孔板，按MTT试剂盒操作，实验需设立3个复孔，在培养基中分别培养24、48、72、96 h，加入15 μl的MTT液(浓度20 μg/L)，以37 ℃温度孵育4 h后加150 μl DMSO，上酶标定量仪，记录490 nm处光密度值，记录细胞增殖率或存活率，3次实验取平均值分析。

1.2.3 DAPI荧光染色法测定核破碎及固缩相 取对数期生长未经转染的SW620细胞及转染miR-346 inhibitor的细胞，以2×105/ml细胞密度接种于6孔板，给予50 μmol/L浓度的OHP继续培养24 h，去除培养液并洗涤后给予4%多聚甲醛进行固定，DAPI染色液0.5 ml/孔进行染色，给予5 min的避光孵育，以荧光显微镜进行观察，计算核破裂及固缩细胞比率。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI流式细胞法检测细胞凋亡 采用流式细胞仪对不同干预因素下的SW620细胞的凋亡率进行检测，以2×105/ml的细胞密度将不同干预因素下的SW620细胞接种于6孔板内，在常规条件下进行细胞培养48 h，收集细胞以PBS液进行洗涤，对照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂说明书，流式细胞仪上样进行细胞凋亡检测，对凋亡率进行统计分析。

1.2.5 Western blot检测凋亡相关蛋白 采用裂解液对各干扰因素处理48 h的细胞进行裂解，裂解后进行总蛋白抽取，进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，电压在电泳时设定为100 V,时间为100 min，冰浴转移至PVDF膜并漂洗,进行60 min封膜，将封闭液吸尽后加入caspase-9(1∶500)、Apaf-1(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)及Bax(1∶500)Ⅰ抗,在4 ℃温度下孵育过夜，TBST进行3次洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗,在室温条件下进行孵育1 h，洗涤10 min后进行显色，方法为ECL发光法，以目的蛋白与GAPDH灰度值比作为灰度值相对表达量，进行统计分析。

2 结果

2.1 miR-346表达对OHP干预的SW620细胞增殖的影响 给予miR-346 mimic及miR-346 inhibitor转染SW620细胞，MTT法结果显示，SW620细胞培养24、48、72、96 h后，miR-346 inhibitor对SW620细胞增殖具有抑制作用，与MOCK组比较，在96 h时差异有统计学意义(t=3.23，P<0.05)。miR-346 mimics对SW620细胞增殖具有促进作用，与MOCK组比较，在48 h、72 h及96 h时差异有统计学意义(t=3.23，P<0.05；t=2.64，P<0.05；t=3.07，P<0.05)。浓度50 μmol/L的OHP培养SW620细胞24、48、72、96 h后，OHP对SW620细胞增殖具有抑制作用，与MOCK组比较，在72 h和96 h时差异有统计学意义(t=2.85，P<0.05;t=2.79，P<0.05)。浓度50 μmol/L的OHP+miR-346 inhibitor联合培养SW620细胞24、48、72、96 h后，对SW620细胞增殖具有抑制作用，与MOCK组及miR-346 inhibitor组比较，在72 h及96 h时差异有统计学意义(t=2.85，P<0.05；t=2.79，P<0.05)；与OHP组比较，在72 h时差异有统计学意义(t=2.16，P<0.05)。给予0、0.5、5、50、500 μmol/L的OHP，或以上浓度OHP+miR-346 inhibitor培养SW620细胞72 h，与OHP组比较，OHP+miR-346 inhibitor组SW620细胞在50 μmol/L及500 μmol/L的OHP浓度下细胞存活率低，差异有统计学意义(t=2.09，P<0.05;t=2.46，P<0.05)。见图1、图2。

图1 不同培养时间对SW620细胞增殖率的影响

2.2 miR-346表达对OHP干预的SW620细胞凋亡的影响 SW620细胞给予不同干预措施培养48 h后，流式细胞术显示，给予miR-346 mimics后SW620细胞凋亡率下降，与MOCK组比较，差异有统计学意义(t=3.23，P<0.05)；给予miR-346 inhibitor或OHP后，SW620细胞凋亡率升高，但与MOCK组比较，差异无统计学意义(t=1.01，P>0.05)。OHP(50 μmol/L)+miR-346 inhibitor共同处理SW620细胞后，与MOCK组比较，差异有统计学意义(t=3.25,P<0.01)，分别与miR-346 inhibitor组或OHP组比较，差异均有统计学意义(t=2.17,P<0.05；t=2.45,P<0.05)。见图3。

图2 不同OHP浓度对细胞存活率的影响

图3 流式细胞术检测不同干预方式下SW620细胞凋亡率

2.3 上调miR-346表达对OHP诱导SW620细胞核的作用 DAPI染色法显示，OHP处理的转染miR-346 inhibitor的SW620细胞核固缩及破碎显著增加，与OHP组或MOCK组比较，差异有统计学意义(F=3.29，P<0.01)。

2.4 miR-346对OHP干预的SW620细胞凋亡蛋白的作用 Western blot检测不同干预下SW620细胞中凋亡相关蛋白caspase-9、Apaf-1、Bcl-2及Bax蛋白表达，结果显示，给予miR-346 mimics后,与MOCK组比较，caspase-9及Bcl-2蛋白水平升高，Apaf-1及Bax蛋白水平下降，差异有统计学意义(t=3.68，P<0.05；t=2.85，P<0.05；t=3.16，P<0.05；t=2.28，P<0.05)；给予miR-346 inhibitor后,与MOCK组比较，caspase-9及Bcl-2蛋白水平下降，Apaf-1及Bax蛋白水平升高，但差异无统计学意义(t=1.65，P>0.05；t=1.02，P>0.05；t=1.15，P>0.05；t=1.05，P>0.05)；给予OHP后,与MOCK组比较，caspase-9及Bcl-2蛋白水平下降，Apaf-1及Bax蛋白水平升高，但差异无统计学意义(t=1.10，P>0.05；t=1.14，P>0.05；t=1.21，P>0.05；t=1.00，P>0.05)；给予OHP+miR-346 inhibitor后,与MOCK组比较，caspase-9及Bcl-2蛋白水平下降，Apaf-1及Bax蛋白水平升高，差异有统计学意义(t=3.43，P<0.05；t=2.54，P<0.05；t=3.06，P<0.05；t=3.17，P<0.05),与miR-346 inhibitor组比较，caspase-9及Bcl-2蛋白水平下降，Apaf-1及Bax蛋白水平升高，两组caspase-9及Bcl-2水平比较差异有统计学意义(t=3.12，P<0.05；t=2.93，P<0.05)；与OHP组比较，caspase-9及Bcl-2蛋白水平下降，Apaf-1及Bax蛋白水平升高，两组caspase-9及Bcl-2水平比较差异有统计学意义(t=2.94，P<0.05；t=3.13，P<0.05)。见图4。

图4 Western blot检测不同干预条件下凋亡相关蛋白水平变化

3 讨论

结直肠恶性肿瘤发现时30%为Ⅳ期或局部晚期，能够达到根治性切除的转移性结直肠癌或局部晚期结直肠癌仍然有治愈的机会，对于不能施行根治性手术的结直肠癌，目前通过转化治疗，仍有可能达到R0切除，获得治愈的机会或延长生存期，降低复发率[6-7]。对于初始不可切除的结直肠癌或进入晚期一线治疗的结直肠癌，积极的化疗或方案中增加靶向治疗药物的综合治疗是目前主流的治疗方案[8-10]。奥沙利铂在结直肠癌辅助治疗、新辅助治疗或转化治疗中均为一线方案用药。奥沙利铂与氟尿嘧啶具有协同作用，但奥沙利铂耐药也是一线治疗终止的主要原因。在方案中，综合靶向药物能够对化疗增效，同时可能延缓化疗药物的耐药性[11]。因此，对治疗靶点的研究是晚期结直肠恶性肿瘤综合治疗的研究热点。越来越多的靶点得到发现，更多的靶向治疗药物被开发并应用于临床，一定程度上延长了晚期结直肠癌患者的生存期。多项研究表明，miRNA与肝癌、结直肠癌、乳腺癌及卵巢癌等多种恶性肿瘤的化疗敏感性及耐药性相关，对miRNA表达水平进行上调或下调，可能对化疗增效或减效，也可能减少化疗药物的耐药性[12-16]。我们在前期实验基础上[5-6]，对miR-346在奥沙利铂对结肠癌细胞杀伤作用中的影响进行了探讨，目的在于发现新的靶基因，为进一步靶向治疗提供新的靶点。

本研究显示，采用拟似剂或抑制剂对SW620细胞中miR-346进行上调或下调后，细胞增殖或凋亡随之上升或下降，表明miR-346对SW620细胞增殖及凋亡具有调控作用，下调其表达会诱发SW620细胞增殖能力下降，凋亡能力增高。对转染miR-346抑制剂的SW620细胞进一步给予奥沙利铂处理，与奥沙利铂单独诱导杀伤对比，增殖率进一步下降，凋亡率进一步增加，表明下调miR-346表达会增加奥沙利铂对SW620细胞的杀伤作用，通过观察细胞破裂及核固缩的比例证明了这种增效作用。本研究对miR-346表达上调或下调后的凋亡相关蛋白进行了检测，结果显示，下调miR-346表达后，凋亡相关蛋白中凋亡蛋白caspase-9及Bcl-2下降，Apaf-1及Bax升高,miR-346抑制剂与奥沙利铂协同处理细胞后，这种蛋白改变较单独应用奥沙利铂更为明显。Caspase-9是半胱氨酸蛋白酶，作为细胞凋亡通路中的关键酶，受到上游基因激活后能够引起caspase的级联反应，调控细胞凋亡[17]。Apaf-1能够激活caspase通路，召集caspase-9,形成凋亡体，促进凋亡[18]。Bcl-2能够诱发线粒体中凋亡因子释放，激活caspase，从而诱发凋亡[19]。本研究表明，miR-346能够影响奥沙利铂对凋亡相关蛋白的作用，但作用的信号通路及准确靶点有待研究。另有研究显示，miR-346在其他恶性肿瘤中可能作用于其他的信号通路。Guo等[20]研究表明，在肝癌中，miR-346可对乳腺癌转移抑制因子1产生下调作用，从而促进肝细胞癌进展。Miao等[21]研究表明，miR-346可以对KLF4发挥靶向调节作用，从而介导神经干细胞分化及增殖。Zhu等[22]研究显示，miR-346在肝细胞癌中靶向作用于SMYD3依赖性通路，从而对肝癌细胞发挥抑制作用[22]。这些研究均表明，miR-346在恶性肿瘤中的作用及其对化疗药物增敏的作用可能是多基因多通路参与的，需要进一步的实验证明。

本研究观察了miR-346水平变化对结肠癌SW620细胞株增殖及凋亡的影响，及其对奥沙利铂介导的结肠癌细胞杀伤作用的增效作用，结果表明，miR-346表达通过调控凋亡相关蛋白增强奥沙利铂对结肠癌细胞的杀伤作用，但miR-346是否可以作为靶向治疗的靶点，其作用的具体靶基因及上游调控其表达的靶基因及通路等研究需要进一步开展。