趋化素样因子超家族成员6在胶质瘤中的表达及临床意义①

韦 俐 杨小骏 王 琦 郑 晓 徐 斌 蒋敬庭 (苏州大学附属第三医院肿瘤生物诊疗中心，江苏省肿瘤免疫治疗工程技术中心，苏州大学细胞治疗研究院，常州 213003)

脑胶质瘤在所有颅内肿瘤中发生率最高，五年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌。最大范围手术切除和术后放化疗是目前胶质瘤的标准治疗方案，但效果欠佳。近年来，免疫治疗和靶向治疗在恶性肿瘤中的应用取得了进展，其中研究较多的是PD-1/PD-L1免疫抑制信号通路。趋化素样因子超家族成员6(chemokine-like factor 6，CMTM6)作为CMTM家族的一员，参与肿瘤的免疫应答，是PD-L1的关键调控因子[1]。本研究采用免疫组化、免疫荧光、Western blot和qRT-PCR，检测脑胶质瘤组织及胶质母细胞瘤细胞系中CMTM6的表达，分析其与临床病理特征及预后生存之间的关系，为胶质瘤的免疫靶向治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1组织标本 收集苏州大学附属第三医院2018年1月～2019年6月经病理确诊及手术切除的胶质瘤组织样本46例(切除深部良性肿瘤手术入路中必须切除的表面无功能皮层组织)，其中低级别组14例(WHOⅠ～Ⅱ级)、高级别组32例(WHOⅢ～Ⅳ级)，正常对照脑组织9例，所有样本采集通过苏州大学附属第三医院伦理委员会审核。

1.1.2试剂 CMTM6 Antibody(NBP1-31183,Nov-us)；GFAP、DAPI(GB12096/G1012,Service)；HRP偶联二抗(Bioworld)；引物(Servicebio)。

1.1.3标准细胞系 人胶质母细胞瘤细胞系U87和U251(中科院上海细胞研究所)，人脑正常胶质细胞系HEB(中科院典型培养物保藏委员会细胞库)。

1.1.4组织芯片 人脑胶质瘤组织芯片HBraG171 Su01(上海芯超生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1免疫组化染色 术中取组织经甲醛固定、石蜡包埋、切片、脱蜡、水化、抗原修复、封闭等处理后，加CMTM6一抗(1∶200稀释)，4℃过夜；加二抗，DAB显色，苏木素复染，树胶封片。由两位病理科高年资医师双盲读片，H-score评分。

1.2.2免疫荧光双染 组织切片脱蜡、水化、抗原修复、画圈自发荧光淬灭，血清封闭，加一抗(GFAP/CMTM6)，湿盒4℃过夜。加二抗(CY3/488)，DAPI染核，封片，镜检拍照。红光(CMTM6)和绿光(GFAP)重合部分为阳性表达。

1.2.3Western blot 提取待测组织和细胞总蛋白，BCA定量，4∶1加入SDS PAGE凝胶电泳(5×)，转膜，全蛋白封闭。加CMTM6一抗(1∶1 000)，4℃过夜。转移条带至相应HRP偶联二抗(1∶5 000)，化学曝光。Image J软件分析CMTM6蛋白表达量。

1.2.4qRT-PCR 提取待测组织和细胞总RNA。逆转录，定量PCR。反应体系25 μl，条件为：95℃预变性10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，循环40次，溶解曲线60～95℃，每15 s升温0.3℃。β-actin为内参，重复3次取平均值，记录Ct值，计算CMTM6 mRNA相对表达量(ΔΔCT法)。引物序列见表1。

2 结果

2.1CMTM6在胶质瘤组织中的表达上调 在胶质瘤组织中CMTM6蛋白和CMTM6 mRNA的表达水平均显著高于正常脑组织(P<0.01)，不同病理级别胶质瘤组织对比，高级别胶质瘤组织中的CMTM6蛋白和CMTM6 mRNA的表达水平明显上调(P<0.05)，见图1A～C。免疫组化染色结果显示，CMTM6蛋白特异性表达于胶质细胞的胞浆和胞膜，在胶质瘤组织中CMTM6阳性表达率显著高于正常脑组织，高级别胶质瘤组织中CMTM6阳性表达率明显上调，见图1D。免疫荧光双染发现，胶质瘤组织中的CMTM6阳性细胞数量明显增加，且荧光强度增强，见图1E。

2.2CMTM6在胶质母细胞瘤细胞系中表达上调人脑正常胶质细胞系(HEB)中CMTM6 mRNA的表达水平显著低于胶质母细胞瘤细胞系(U87、U251)(P<0.01)，见图2A。在U87、U251中，CMTM6蛋白的转录和表达量明显高于HEB，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2B。

表1 CMTM6、β-actin引物序列

Tab.1 CMTM6 and β-actin primer sequence

GeneSequence(5'-3')CMTM6Forward5'-AGTGCCTTTCTTCTGAGTCTCCTT-3'Reverse5'-CTTCAGCCCTAGTGGTATTTTCAG-3'β-actinForward5'-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3'Reverse5'-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3'

图1 CMTM6在胶质瘤组织中的表达Fig.1 Expression of CMTM6 in glioma tissuesNote:A.H-score semi-quantitative expression of CMTM6;B.CMTM6 mRNA expression was detected by qRT-PCR;C.Expression of CMTM6 protein was detected by Western blot;D.Expression of CMTM6 in human glioma tissues(immunohistochemical staining,HE,×100,×200,×400,scale:100 μm,50 μm,25 μm);E.Expression of CMTM6 in human glioma tissues(immunofluorescence double staining,×200)，red:CMTM6 positive cells;green:glial cells;blue:nucleus.Compared with normal,**.P<0.01;compared with Low-grade,*.P<0.05.

2.3CMTM6表达上调与胶质瘤患者病理分级呈正相关 胶质瘤组织芯片进行免疫组化染色，见图3。以cut-off值40.9为截点，定义H-score>40.9为高表达，H-score≤40.9为低表达。CMTM6的表达水平与病理分级相关(χ2=7.238,P=0.007)，但与患者的性别、年龄、肿瘤直径以及周围组织是否浸润无相关性(P>0.05)，见表2。

2.4CMTM6表达上调与胶质瘤预后不良相关 CMTM6高表达患者的总生存期和无病生存期均比低表达患者明显缩短(OS:P=0.002;DFS:P=0.007)，见图4。CMTM6高表达患者的五年累积总生存率和无病生存率(OS:64%;DFS:47%)较低表达患者(OS:86%;DFS:68%)呈明显下降趋势，见图5。多因素Cox回归分析显示，年龄(OS:HR=3.946,P<0.001;DFS:HR=2.605,P<0.001)、病理分级(OS:HR=13.937,P<0.001;DFS:HR=6.118,P<0.001)及CMTM6的表达(OS:HR=2.504,P=0.017;DFS:HR=1.603,P=0.047)都是评判胶质瘤预后的独立危险因素，见表3～4。

图2 胶质母细胞瘤细胞系中CMTM6的表达Fig.2 Expression of CMTM6 in glioblastoma cell linesNote:A.CMTM6 mRNA expression was detected by qRT-PCR;B.Expression of CMTM6 protein was detected by Western blot.Compared with HEB，**.P<0.01.

图3 胶质瘤组织芯片中CMTM6的表达Fig.3 Expression of CMTM6 in glioma tissue microarrayNote:Immunohistochemistry staining,H&E,×50,×200,×400,scale:200 μm,50 μm,25 μm.

表2 胶质瘤组织芯片中CMTM6表达与临床病理特征的关系

Tab.2 Correlation between CMTM6 expression and clinicopathological characteristics in glioma tissue microarray

ClinicopathologicalfeaturesnCMTM6H-score>40.9H-score≤40.9χ2PSex0.0720.789Male1097732Female624319Age(year)2.4110.120<40744826≥40977324Tumor diameter0.0250.518≥4 cm1118229<4 cm604317Peripheral infiltration0.1780.430Yes463511No1258936Tissue classification7.2380.0071)Ⅰ-Ⅱ996237Ⅲ-Ⅳ725913

Note:1)P<0.05.

图4 CMTM6的表达与胶质瘤患者生存预后的相关性Fig.4 Correlation between expression of CMTM6 and survival and prognosis of glioma patientsNote:A.Correlation between CMTM6 expression and total postoperative survival of glioma patients，P=0.002；B.Correlation between CMTM6 expression and disease-free postoperative survival in glioma patients，P=0.007.

表3 胶质瘤患者总生存期影响因素Cox回归分析

Tab.3 Cox regression analysis of factors influencing total survival of glioma patients

Clinical parametersSingle factor CoxHR95%CIP-valueMultiariable CoxHR95%CIP-valueSexMale/Female1.483 0.841-2.6160.174 1.819 1.009-3.2790.064Age(year)≥40/<403.201 1.723-5.946<0.001)3.946 2.056-7.575<0.0011)Tissue classificationⅢ-Ⅳ/Ⅰ-Ⅱ13.956 6.578-29.608<0.0011)13.937 6.519-29.795<0.0011)CMTM6 expressionHigh/Low3.0271.431-6.4010.0041)2.5041.177-5.3240.0171)

Note:1)P<0.05.

表4 胶质瘤患者无病生存期影响因素Cox回归分析

Tab.4 Cox regression analysis of factors influencing disease-free survival in glioma patients

Clinical parametersSingle factor CoxHR95%CIP-valueMultiariable CoxHR95%CIP-valueSexMale/Female1.374 0.888-2.1250.154 1.555 0.995-2.4320.053 Age(year)≥40/<402.402 1.538-3.753<0.0011)2.605 1.647-4.120<0.0011)Tissue classificationⅢ-Ⅳ/Ⅰ-Ⅱ6.263 3.997-9.814<0.0011)6.118 3.880-9.646<0.0011)CMTM6 expressHigh/Low2.1361.275-3.5810.0041)1.6030.955-2.6930.0471)

Note:1)P<0.05.

图5 胶质瘤患者五年累积总生存率及无病生存率变化趋势Fig.5 Trend of 5-year cumulative total survival rate and disease-free survival rate in glioma patientsNote:A.Trend of 5-year cumulative total survival in glioma patients;B.Trend of 5-year cumulative disease-free survival rate in glioma patients.

3 讨论

CMTM6是一种成簇存在于染色体3p22上，含有MARVEL结构域的免疫相关非特异性蛋白。和家族其他成员一样，CMTM6广泛表达于各类组织细胞表面，也是多种肿瘤的抑制位点，其编码的产物蛋白可以激活和趋化免疫细胞，通过调控细胞周期和信号通路，在肿瘤的发展和转移中起重要作用[2-4]。有研究报道，CMTM6的异常表达与肝细胞癌、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌和脑胶质瘤等肿瘤的发生发展有关[5-8]。

胶质瘤的边界不清，多呈浸润性生长，具有很强的增殖侵袭能力和化疗耐受性[9]。尽管近年来手术和影像定位技术不断进步，化疗药物及放疗技术不断更新，但仍不能避免胶质瘤的复发[10]，患者平均中位生存期不超过14.6个月[11]。因此，探索胶质瘤的临床治疗新方法成为研究热点。目前，FDA已经批准肿瘤免疫和靶向治疗用于黑色素瘤和非小细胞肺癌等肿瘤，在临床治疗上展现出了广阔的前景。研究证实，中枢神经系统并非是“免疫豁免”区[12]，也存在淋巴管和完整的免疫调控系统。另外，胶质瘤浸润性生长会破坏人血脑屏障的完整性，使淋巴细胞更容易进出脑组织[13]，而趋化因子的存在也可以帮助淋巴细胞穿过血脑屏障[14]。

国外研究报道，CMTM家族中的多个基因和胶质母细胞瘤有密切关系，其中CMTM6在胶质母细胞瘤中高表达[15]。本研究显示，CMTM6在胶质瘤中高表达，且在高级别组中表达高于低级别组，与既往研究结果相符。另有学者通过转录组和基因组数据库分析，发现CMTM6在胶质瘤中表达显著上调，且与患者存活时间减少有关[7]。我们通过对胶质瘤组织芯片的免疫组化结果进行分析，发现CMTM6的表达与患者总生存期和无病生存期均有关，CMTM6表达越高，患者的生存期越短，与上述研究结果一致。因此，CMTM6可作为一个独立危险因子来评估胶质瘤患者的预后。

PD-1/PD-L1是通过抑制T细胞增殖活化来负性调控人体免疫应答的免疫抑制信号通路，目前已成为肿瘤治疗的研究焦点。虽然Burr等[6]通过全基因组CRISPR-Cas9发现CMTM6作为PD-L1的关键调控因子，在多种肿瘤细胞中维持其有效表达，阻止其成为溶酶体降解的靶点，但在胶质瘤中的具体作用机制尚不明确。未来，以CMTM6为靶点阻断PD-1/PD-L1信号通路或可成为胶质瘤治疗的一个新的方向[16]。我们将通过构建慢病毒载体转染细胞系进行细胞功能及PD-L1调控机制实验，深入探究CMTM6与胶质瘤复杂的免疫应答间的关系。