舒肝解郁饮对抑郁大鼠行为学及作用机制研究①

李 宁 周珊珊 胡 蕊 高媛媛 王潮敏 王育梅

(河北医科大学第一医院精神卫生科,石家庄 050000)

抑郁症为各种原因引起的一组心境障碍和情感障碍，主要症状为抑郁，是以抑郁心境自我体验为中心的临床症状群[1]。CRP、FGF、TNF-α水平变化与抑郁症的发生与发展密切相关，长期应激可引起CRP和TNF-α表达升高、使FGF表达降低，从而引起脑额叶神经元神经元再生障碍，从而引起抑郁的发生:如Roomruangwong C1发现妊娠和分娩可引起CRP水平升高，高CRP水平可预测产后抑郁症[2]；Liu等[3]研究发现将小鼠暴露于慢性轻度压力4周可引起小鼠血浆TNF-α等促炎因子水平升高，促炎因子水平的升高通过上调吲哚胺2,3-双加氧酶及皮质神经元损伤介导慢性轻度压力诱导的抑郁症。舒肝解郁饮具有健胃消食、清热除烦、舒肝解郁、养心安神等功效，治疗抑郁症效果显著[4]。目前的研究对舒肝解郁饮治疗抑郁时额叶CRP、FGF、TNF-α水平变化尚不清楚，对此，本文建立大鼠抑郁模型，给予舒肝解郁饮治疗，观察其对大鼠行为学及额叶CRP、FGF、TNF-α水平的影响，探讨舒肝解郁饮治疗抑郁症的可能机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 清洁级、雄性Wistar大鼠60只，体重190～210 g，购自北京生命科学研究所，许可证号SYXK(京)2015-0003。

1.1.2舒肝解郁饮 主要成分为柴胡15 g、郁金15 g、香附15 g、当归15 g、木香10 g、半夏10 g、陈皮15 g、三仙45 g、白芍15 g、酸枣仁20 g、川穹10 g、丹皮20 g、丹参20 g、瓜萎20 g等，将上述中药成分加水剪成每100 ml溶液含生药量350 g的煎剂。

1.1.3主要试剂 脑组织CRP、FGF、TNF-α试剂盒(美国Sigma公司)，小鼠抗大鼠CRP单克隆抗体(货号:bsm-0391M)、小鼠抗大鼠FGF单克隆抗体(货号:ab8880)、小鼠抗大鼠TNF-α单克隆抗体(货号:CL-0387T)、β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)等。

1.2方法

1.2.1大鼠分组和抑郁大鼠模型建立 将60只大鼠根据随机数字表法分为对照组、模型组、舒肝解郁饮低剂量组、舒肝解郁饮高剂量组，每组15只。模型组、舒肝解郁饮低剂量组、舒肝解郁饮高剂量组大鼠采用慢性不可预见性应激建立抑郁大鼠模型，采用7种应激方式，分别为禁水24 h、禁食24 h、夹尾(止血钳在距离大鼠尾根部1 cm处夹尾持续1 min)、足底电击(电压36 V、电流1 mA，电击1次/10 s，持续10 s，共电击10次)、4℃冰水中游泳(5 min)、大鼠笼倾斜45°(7 h)、昼夜颠倒(24 h)。7种应激方式每天1种，每周循环1次，每周采用不同的时间点和不同顺序，共21周。对照组大鼠不给予任何应激。造模过程中，模型组大鼠死亡2只，舒肝解郁饮低剂量组和舒肝解郁饮高剂量组大鼠各死亡1只，对照组大鼠没有死亡。

1.2.2各组大鼠给药 在造模3周结束时进行敞箱实验判断造模是否成功，第22天开始舒肝解郁饮低剂量组和舒肝解郁饮高剂量组大鼠分别给予剂量为30 g/kg和60 g/kg的舒肝解郁饮煎剂灌胃，共3周。对照组和模型组大鼠给予等量的生理盐水。

1.2.3大鼠抑郁行为学评价 采用敞箱实验评价大鼠抑郁行为:制作一个40 cm×80 cm×80 cm的敞箱，敞箱的底面和内壁漆成黑色，将敞箱底面分成25个面积相等的方格，把大鼠放在敞箱中央，水平运动得分为穿越底面方格数，穿越1格得1分；垂直得分为双足离地的直立次数，双足离地1次得1分，共测定5 min。

1.2.4标本采集 各组大鼠敞箱实验结束后断头，快速在冰上取脑组织，分离大鼠额叶组织用于测定脑组织CRP、FGF、TNF-α水平。

1.2.5额叶CRP、FGF、TNF-α水平测定 将各组大鼠额叶脑组织加入生理盐水捣碎，3 000 r/min离心10 min，取上清液，采用ELISA法测定额叶CRP、FGF、TNF-α水平(具体步骤严格按照试剂盒说明书进行)。

1.2.6额叶CRP、FGF、TNF-α蛋白水平测定 采用Western blot法测定额叶CRP、FGF、TNF-α蛋白水平:每只小鼠取300 mg脑组织加入裂解液匀浆后提取各组大鼠额叶脑组织总蛋白质，采用分光光度检测仪测量蛋白浓度，在95℃水浴中配置上样液，将脑组织蛋白样品和上样液以1∶1比例混匀，进行电泳(每孔蛋白上样量为30 μg)、转膜、封闭，封闭后置入一抗(以小鼠抗大鼠CRP单克隆抗体、小鼠抗大鼠FGF单克隆抗体、小鼠抗大鼠TNF-α单克隆抗体为一抗，抗体稀释比例1∶500)中过夜孵育，以β-actin为内参照，放入二抗(稀释比例1∶2 000)中孵育2 h，加入显影液显影。

2 结果

2.1各组大鼠敞箱测试分值比较 与对照组比较，模型组敞箱实验水平运动得分和垂直运动得分均明显降低(P<0.05)；与模型组比较，舒肝解郁饮低剂量组、舒肝解郁饮高剂量组敞箱实验水平运动得分和垂直运动得分均明显升高(P<0.05)；与舒肝解郁饮低剂量组比较，舒肝解郁饮高剂量组敞箱实验水平运动得分和垂直运动得分均升高(P<0.05)。见表1。

2.2各组大鼠额叶CRP、TNF-α水平比较 与对照组比较，模型组额叶CRP、TNF-α水平均升高(P<0.05)，FGF水平降低(P<0.05)；与模型组比较，舒肝解郁饮低剂量组、 舒肝解郁饮高剂量组额叶CRP、FGF、TNF-α水平均降低(P<0.05)，FGF水平升高(P<0.05)；与舒肝解郁饮低剂量组比较，舒肝解郁饮高剂量组额叶CRP、TNF-α水平均降低(P<0.05)，FGF水平升高(P<0.05)。见表2。

GroupsnHorizontalsports scoreVerticalmotion scoreControl group1595.74±16.3732.36±9.42Model group1334.25±10.481)12.17±3.851)Shugan Jieyu Yin low dose group1447.26±12.311)2)18.83±4.261)2)Shugan Jieyu Yin high dose group1458.38±13.641)2)3)23.24±5.171)2)3)F55.14226.199P<0.001<0.001

Note：Compared with the control group,1)P<0.05；compared with the model group,2)P<0.05;compared with Shugan Jieyu Yin low dose group,3)P<0.05.

图1 各组大鼠额叶CRP、FGF、TNF-α蛋白Western blot电泳图Fig.1 Western blot analysis of CRP,FGF and TNF-α protein in frontal lobe of each groupNote:1.Control group;2.Model group;3.Shugan Jieyu Yin low dose group;4.Shugan Jieyu Yin high dose group.

GroupsnCRP(ng/L)FGF(ng/L)TNF-α(ng/L)Control group151 148.53±142.35126.43±11.62667.48±23.14Model group132 174.28±186.471)67.51±8.741)812.68±26.531)Shugan Jieyu Yin low dose group141 654.32±164.361)2) 81.02±9.321)2)754.25±23.161)2)Shugan Jieyu Yin high dose group141 375.46±152.131)2)3) 92.51±9.851)2)3)720.51±24.021)2)3)F103.01390.78588.264P<0.001<0.001<0.001

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05;compared with Shugan Jieyu Yin low dose group,3)P<0.05.

GroupsnRelative expressionof CRP proteinRelative expressionof FGF proteinRelative expressionof TNF-α proteinControl group151.00±0.011.00±0.021.00±0.01Model group134.32±0.731)0.41±0.041)2.69±0.121)Shugan Jieyu Yin low dose group143.24±0.581)2)0.57±0.061)2)1.96±0.091)2)Shugan Jieyu Yin high dose group142.15±0.511)2)3)0.80±0.071)2)3)1.53±0.081)2)3)F104.620361.0391 013.477P<0.001<0.001<0.001

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05;compared with Shugan Jieyu yin low dose group,3)P<0.05.

2.3各组大鼠额叶CRP、FGF、TNF-α蛋白水平比较 与对照组比较，模型组额叶CRP、TNF-α蛋白水平均升高(P<0.05)，FGF蛋白水平降低(P<0.05)；与模型组比较，舒肝解郁饮低剂量组、舒肝解郁饮高剂量组额叶CRP、TNF-α蛋白水平均降低(P<0.05)，FGF蛋白水平升高(P<0.05)；与舒肝解郁饮低剂量组比较，舒肝解郁饮高剂量组额叶CRP、TNF-α蛋白水平均降低(P<0.05)，FGF蛋白水平升高(P<0.05)。见表3，图1。

3 讨论

抑郁症发病率高，是情感性障碍的一种类型，主要特征为显著而持久的情绪低落，主要表现为精神运动性抑制、思维迟缓、情绪低落，部分抑郁症患者出现自杀观念和行为，抑郁症为精神科自杀率最高的疾病，给患者和家属带来巨大痛苦，对社会造成巨大损失[5]。抑郁症发生的主要原因为神经中枢5-羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素等神经递质水平降低及其受体功能降低。另有研究表明，抑郁症发生和炎症细胞因子水平关系密切，炎症细胞因子水平越高则抑郁症的程度越严重[6]。CRP在组织损伤和感染时浓度迅速升高，是组织损伤时机体急性反应产物，抑郁症的发病伴随免疫炎症反应的激活，炎症细胞因子分泌增加、出现明显的炎症级联反应[7]，抑郁症患者血清CRP水平升高，如何晓燕等[8]研究发现抑郁症患者血清hs-CRP水平升高。TNF-α参与机体的体液和细胞免疫，影响中枢神经递质释放，具有免疫调节、杀伤肿瘤细胞、参与炎症反应的作用，在免疫反应和炎症反应的启动和维护中发挥重要作用，在生理条件下TNF-α不通过血脑屏障，病理情况下外周TNF-α进入脑内，与脑内的细胞因子一起影响神经的生化和行为等，发挥炎症细胞因子的中枢效应，抑郁症伴有免疫炎症反应的激活[9]，抑郁症患者TNF-α水平升高，如伏箫燕等[10]研究发现抑郁症大鼠脑内TNF-α被激活。FGF是神经元成活和生长、新皮质发育、干细胞增殖的重要因素，可诱导前体细胞向多巴胺能神经元和5-羟色胺神经元分化，与神经的可塑性关系密切，在大脑的发育中发挥重要作用[11,12]，抑郁症患者FGF水平下降，如徐宇浩等[13]研究发现抑郁症患者血清FGF-22水平下降。额叶在调节抑郁症患者认知和情绪中发挥重要作用，参与抑郁症患者的病理生理过程，研究发现抑郁行为小鼠额叶TNF-α等炎症细胞因子水平升高[14]，慢性应激抑郁大鼠额叶皮层FGF-2水平下降[15]。本研究对慢性不可预见性应激抑郁大鼠额叶CRP、FGF、TNF-α水平进行研究，结果发现抑郁大鼠额叶CRP、TNF-α水平升高，FGF水平降低，与上述研究报道结果一致。

中医认为，肝的疏泄功能受人的情志影响，情志异常可引起肝气郁结，肝气郁结可引起血瘀、影响脾的运化，脾失健运可引起食郁、痰郁、湿郁，诸郁日久化热，病情迁延，病邪耗气伤血劫阴，产生肝肾阴虚、心脾气血两虚，从而引起抑郁症的发生[16]。中药在抑郁症的治疗中有一定疗效，可通过影响脑内炎症因子发挥改善抑郁症状的作用，如沈军等[17]研究发现当归提取物可通过调控大鼠额叶炎症细胞因子水平改善慢性不可预知性应激大鼠的抑郁症状；杜青等[18]研究发现百合疏肝安神汤可能通过对大鼠额叶、海马等组织中炎症细胞因子水平的影响发挥抗抑郁的作用。舒肝解郁饮组方中，柴胡为君药，具有行气疏肝解郁的功效；木香具有行气止痛功效；香附具有理气疏肝功效；郁金辛寒行散、入血而行气；川穹祛风止痛、活血行气；当归养血和血等，主要合用具有清热除烦、健胃消食、养心安神、舒肝解郁的功效，在抑郁症的治疗中具有良好效果[19]。本文对舒肝解郁饮对抑郁大鼠额叶CRP、FGF、TNF-α水平的影响进行研究，探讨其治疗抑郁症的可能机制，结果发现疏肝解郁饮可改善大鼠的抑郁行为，降低额叶CRP、TNF-α水平，升高FGF水平。表明舒肝解郁饮对抑郁症大鼠的抑郁症状具有改善作用，其机制可能通过促进神经元增殖与修复，降低抑郁症大鼠额叶炎症细胞因子活性，抑制免疫炎症反应，从而调节机体免疫系统，发挥对大鼠抑郁行为的影响。