1-芘丁酸单克隆抗体的制备及免疫学性能鉴定①

胡骁飞 孔蒙蒙 邢广旭 邢云瑞 孙亚宁 张改平

(河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，郑州 450002)

1-芘丁酸(1-Pyrenebutyric acid,PBA)是多环芳烃最常见的一种衍生物[1]，由有机物的热解和不完全燃烧产生，主要存在于水、空气和土壤中[2]。食品由于原料产地污染程度及加工方式不同，PBA含量也会产生差异[3]，人类主要通过皮肤、呼吸、受污染的水和食物摄入等途径接触多环芳烃[3-5]。多环芳烃具有强烈致癌性、致畸性和致突变性，在人体内的代谢产物可以和DNA分子发生共价结合，使细胞中DNA的复制出现错误，增加突变的概率，导致癌症的发生，对人体造成极大的危害[6-8]。PBA还具有雌激素的作用，危害机体免疫系统，损害机体生殖健康[9]。鉴于此，美国环境保护署将多环芳烃列为需要优先控制的污染物[10]，我国也将其列入“中国环境优先污染物黑名单”[11]。

目前，检测多环芳烃及其衍生物的方法主要是理化检测，包括高效液相色谱法、气相色谱法、荧光法、电泳法以及各种衍生方法[12-15]。理化检测灵敏度及准确度均比较高，因此其检测结果常常可以作为解决食品安全争端及国际贸易争端的仲裁依据；但理化检测样品前处理过程比较繁琐，检测耗时长，费用高，且仪器比较昂贵，对操作者技术要求高，限制了其应用。免疫学检测技术是利用抗原和抗体之间的特异性反应并结合各种标记技术建立的检测技术，具有灵敏度高、特异性好、耗时短及检测费用低等优点，且仪器相对便宜，因此在食品安全监控、环境保护、疫病诊断领域得到了广泛的应用[16,17]。本试验拟通过细胞融合技术筛选出分泌抗PBA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，从而制备灵敏度高、特异性强的PBA单克隆抗体，为建立PBA的免疫学快速检测方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂 PBA(纯度97%) 购自Alfa Aesar公司；PBA甲醇、萘购自Innochem公司；1-芘甲醛购自Aladdin公司；菲购自Ark公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、卵清蛋白(ovalbumin,OVA)购自BDH公司；弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)购自Sigma公司；RMPI-1640细胞培养基、HT培养基、HAT培养基购自Solarbio科技有限公司；其他试剂均为市售分析纯(AR)。磷酸盐缓冲液(PBS)、碳酸盐缓冲液(CBS)、PBS+Tween-20洗液(PBST)、封闭液、显色液、终止液由河南省农科院动物免疫学重点实验室配制。

1.1.2实验动物 6～7周龄SPF级BALB/c雌性小鼠购自郑州大学医学院，由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室饲养。

1.2方法

1.2.1PBA人工抗原的制备及质量鉴定

1.2.1.1PBA人工抗原的制备 EDC法制备PBA的免疫原PBA-BSA和包被原PBA-OVA，具体如下：称取PBA 5 mg溶于0.5 ml N,N-二甲基甲酰胺中，加入等摩尔质量的NHS和EDC，室温反应0.5 h。称取载体蛋白BSA 14.4 mg溶于2 ml的PBS缓冲液中，取上述PBA溶液逐滴加入BSA溶液中，室温反应4～5 h后，4℃对PBS缓冲液透析3 d(每天换透析液3次)，5 000 r/min离心10 min，弃去沉淀，取上清液，保存到-20℃冰箱中备用。具体路线见图1。包被原PBA-OVA的合成方法与此相同。

1.2.1.2PBA人工抗原的鉴定 根据文献[18]，分别采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法及动物免疫法对制备的人工抗原进行质量鉴定。

动物免疫鉴定时，用制备的免疫原免疫BALB/c雌性小鼠，免疫剂量为10 μg蛋白/只，每次200 μl，背部皮下4～6点注射，共免疫4次。首先将100 μl浓度为200 μg/ml的人工抗原PBA-BSA与等量FCA混合均匀，完全乳化；后三次免疫将FCA换成FIA，其他步骤完全一致。免疫间隔21 d。最后一次免疫10 d后断尾采血10 μl，加入到990 μl PBS中，混匀，5 000 r/min离心10 min，弃沉淀，上清保存到-20℃冰箱中备用。间接ELISA测定血清效价，间接竞争(阻断)ELISA测定灵敏度，选择效价高和灵敏度好的小鼠进行细胞融合。

1.2.2细胞融合和杂交瘤细胞的筛选 选择效价和灵敏度良好的小鼠进行超免，超免剂量为50 μg蛋白/只，将PBA-BSA用高压灭菌的PBS缓冲液稀释到250 μg/ml，取200 μl腹腔注射到用于细胞融合的小鼠，超免3 d后取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，融合过程参照文献[18]，并做了微小修改，使用的骨髓瘤细胞为SP2/0。间接ELISA和阻断ELISA对杂交瘤细胞株进行筛选。

1.2.3PBA单抗的制备及免疫学特性鉴定

1.2.3.1PBA单抗制备 采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体[16]。对健康的BALB/c小鼠腹腔注射500 μl灭菌的液体石蜡，10 d后将细胞株以5×105/500 μl的剂量注射到小鼠腹腔内，7～10 d后采集小鼠腹水，5 000 r/min离心10 min。-20℃冰箱保存备用。

1.2.3.2PBA单抗免疫学特性鉴定 单抗效价采用间接ELISA测定。单抗灵敏度测定：分别配制浓度为5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078 125、0 ng/ml的PBA标准品溶液，以间接竞争ELISA测定抗体灵敏度。单抗亚型鉴定按照单克隆抗体亚型试剂盒鉴定步骤进行操作；单抗亲和力测定:根据参考文献[18]把PBA-OVA稀释到1 μg/ml和0.5 μg/ml进行包板，采用间接ELISA法对单克隆抗体亲和力进行测定，计算其亲和力常数Ka值；单抗特异性测定：间接竞争ELISA测定单克隆抗体与PBA的类似物1-芘甲醇、1-芘甲醛、苯并芘、菲、萘、芘以及BSA和OVA之间的交叉反应。

图1 PBA-BSA合成路线Fig.1 Synthesizing route of PBA-BSA

2 结果

2.1PBA人工抗原的质量鉴定

2.1.1PBA-BSA的SDS-PAGE 人工抗原PBA-BSA的SDS-PAGE结果见图2。BSA比PBA-BSA移动的稍微快一些，根据SDS-PAGE原理，分子量小的物质比分子量大的物质移动速度要快，因此PBA-BSA分子量应比BSA要稍大一些，初步证明PBA成功偶联到BSA上。

2.1.2PBA-BSA免疫小鼠血清效价及灵敏度 免疫小鼠血清效价测定结果见表1。由表1可知，第4次免疫10 d后，免疫的4只小鼠均产生了抗体，血清效价在1.6×103～1.28×104在之间。其中1和4号小鼠效价均达到1.28×104。

图2 BSA PBA-BSA 的SDS-PAGE图Fig.2 The SDS-PAGE map of BSA PBA-BSANote: 1.BSA；2.PBA-BSA；3.Marker protein.

表1 免疫小鼠血清效价

Tab.1 Serum titer of immunized mice

NO.2004008001 6003 2006 40012 800Blank11.4301.2540.9390.8650.8070.4910.2910.1320.7040.5520.2890.1810.0410.0390.0320.02830.6800.5600.3880.2080.0590.0460.0260.01841.6501.6291.2051.0130.7490.4960.2420.021

免疫小鼠血清灵敏度测定结果见表2。由表2可知，4只小鼠血清抗体都能够被PBA抑制，半数抑制浓度(IC50)在150～4.69 ng/ml，其中4号小鼠的IC50最好，由其抑制曲线(图3)计算IC50为4.77 ng/ml。此结果表明，本实验采用的偶联方法正确，成功制备出了PBA人工抗原。4号小鼠的血清效价最高，且灵敏度最好，因此选择4号小鼠用作细胞融合。

2.2PBA单克隆抗体(PBA-mAb)特性鉴定

2.2.1PBA-mAb 效价 4号小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合后，经过有限稀释法亚克隆和ELISA筛选，最后得到1株能够稳定分泌抗PBA-mAb的杂交瘤细胞10C2A6，通过体内诱生腹水法批量制备出抗体。间接ELISA测定了腹水效价，细胞上清的效价为1∶1 600，腹水的效价为1∶2.56×105。

2.2.2PBA-mAb灵敏度 PBA-mAb灵敏度测定结果线性回归方程为y=-0.422 9x+0.471 4，R2=0.987 2，经计算，其IC50为0.86 ng/ml(图4)。

2.2.3PBA-mAb亚型 采用单克隆抗体亚型测定试剂盒对PBA-mAb的亚型进行了鉴定，结果如图5所示，PBA-mAb的亚型为IgG2b型。

2.2.4PBA-mAb亲和力 PBA-mAb亲和曲线如图6 所示，当包被原浓度为1.0 μg/ml和0.5 μg/ml时，PBA-mAb与抗原结合达到50%饱和状态时的浓度分别为3.16 μg/ml和2.85 μg/ml，通过亲和常数公式计算出亲和常数Ka为1.96×109L/mol。

图3 4号小鼠血清抑制曲线Fig.3 Serum inhibitory curve of No.4 mouse

表2 免疫小鼠血清灵敏度

Tab.2 Serum sensitivity of immunized mice

No.PBA concentration (ng/ml)300150753718.759.384.692.34PositiveBlank10.410.4310.7240.7490.8521.0121.0011.1321.2340.02520.1680.2740.3880.5420.6320.8940.9511.1121.0320.01530.0640.0940.1020.1480.3560.4780.6320.8030.8750.02340.0140.0360.0680.1320.2380.4780.5320.6831.0460.004

图4 PBA-mAb的抑制曲线Fig.4 Inhibition curve of PBA-mAb

图5 PBA-mAb亚型鉴定Fig.5 Subtype identification of PBA-mAb

2.2.5PBA-mAb特异性 PBA-mAb特异性测定结果如表3所示，由表可知1-芘丁酸的IC50为0.86 ng/ml，与1-芘甲醇、1-芘甲醛以及芘的交叉反应率分别为0.63%、1.42%和1.74%，与菲、萘、苯并芘、BSA以及OVA的交叉反应率均小于0.05%。因此PBA-mAb具有良好的特异性。

3 讨论

PBA相对分子量为288.34,属于小分子半抗原化合物，由于其自身结构简单，不具有免疫原性，因此不能直接刺激机体产生抗体[19]。为了获得抗PBA的抗体，必须将其与大分子载体蛋白如BSA、OVA及钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)或者非抗原性的多聚赖氨酸等物质进行偶联制备人工抗原，才能刺激机体产生相应的抗体。由于PBA含有羧基，可以与载体蛋白的氨基进行缩合，因此本研究中直接采用了EDC法进行人工抗原制备。通过动物免疫及血清检测，制备的人工抗原免疫动物能够产生抗PBA抗体，说明采用EDC法制备PBA的人工抗原是可行的，能够制备出符合质量要求的人工抗原，为PBA-mAb的制备奠定了良好基础。

图6 PBA-mAb亲和曲线Fig.6 Affinity curve of PBA-mAb

表3 PBA-mAb特异性

Tab.3 Specificity of PBA-mAb

CompoundsIC50(ng/ml)Cross reactivity (%)PBA0.86100.00Pyrene49.501.741-Pyrenecarboxaldehyde60.461.421-Pyrenemethanol137.400.63Phenanthrene2 099.94<0.05Naphthalene>1.00×104<0.05Benzoapyrene>1.00×104<0.05BSA>1.00×104<0.05OVA>1.00×104<0.05

PBA-mAb制备过程中，特异性鉴定至关重要，如果只是用间接ELISA进行效价鉴定筛选，所制备的单克隆抗体可能效价比较高，但特异性不一定强。笔者多年的抗体制备研究工作经验表明，抗体效价高不一定能够保证抗体针对相应的小分子半抗原具有很强的特异性。抗原和抗体特异性结合的分子机制是抗原分子表面存在着能与抗体相互作用的部位，即抗原决定簇，是抗原决定簇的空间结构与抗体分子超变区互补以及氢键、疏水性、静电作用等形成的低能势共同作用的结果，即抗体是从抗原决定簇的立体结构，而不是从抗原的全面分子排列来“认识”抗原的[20]。因此，小分子半抗原的空间构像对抗体免疫学特性有决定性影响。在小分子半抗原偶联制备人工抗原的过程中可能会使小分子的抗原决定簇结构发生改变，且小分子半抗原只有一个抗原决定簇[21]，因此小分子的抗原决定簇结构发生变化意味着用制备的人工免疫原免疫动物时产生的抗体，并不一定是完全针对小分子的，甚至与小分子没有任何特异性反应。由于载体蛋白与小分子半抗原偶联来制备人工免疫原和人工包被原时，所制备的人工免疫原和人工包被原中小分子结构基本完全一致，因此人工免疫原免疫动物后，用相应的人工包被原检测抗体效价时，显示抗体效价比较高。如果想要得到效价高、特异性强的单克隆抗体，必须在细胞融合时对杂交瘤细胞同时进行间接ELISA的效价筛选和阻断ELISA的特异性筛选，这样才能保证所得到的抗体是目标抗体[18]。

本研究中，通过细胞融合，杂交瘤筛选，有限稀释亚克隆，筛选出1株能分泌抗PBA单克隆抗体的杂交瘤细胞株10C2A6，通过体内诱生腹水批量制备出单克隆抗体，亚型为IgG2b型，IC50为0.86 ng/ml，亲和力为1.96×109mol/L，除了与1-芘甲醇、1-芘甲醛以及芘交叉反应率分别0.63%，1.42%及1.74%交叉反应率外，与其他物质交叉反应率均小于0.05%。本研究成功制备出了亲和力高、灵敏度好、特异性强的PBA-mAb，为其高灵敏免疫学检测方法的建立奠定了良好的基础。