黑色素瘤缺乏因子2在胆管癌组织中的表达及其临床意义①

郑盼盼 肖文璐 黄 浩 武少贤 李 源 郑 晓 陈陆俊 蒋敬庭 (苏州大学附属第三医院肿瘤生物诊疗中心，江苏省肿瘤免疫治疗工程技术研究中心，苏州大学细胞治疗研究院,常州 213003)

胆管癌起源于胆道上皮细胞，其异质性很强，是一种恶性程度高、预后差且仅次于肝细胞癌的第二大原发性肝脏肿瘤[1]。近年来，胆管癌的发病率呈逐年上升趋势，手术是其主要治疗手段，但5年生存率极低，且由于缺乏较好的检查手段，多数患者确诊即为晚期[2]。因此寻求早期诊断标志物对于胆管癌预后至关重要。黑色素瘤缺乏因子2(Absent in melanoma 2,AIM2)是干扰素诱导的HIN-200蛋白家族成员，在结肠癌[3]、乳腺癌[4]和前列腺癌[5]等几种类型的肿瘤中发挥抑制作用，但AIM2在胆管癌中的表达情况及其临床意义尚不明确。因此本研究采用免疫组化检测胆管癌及正常组织中AIM2的蛋白表达水平，进一步分析其临床意义及预后价值，为胆管癌诊疗提供新的生物学标记和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1材料 胆管癌组织芯片购自上海芯超生物科技有限公司(产品批号：HBiDC122Su01),该芯片共含有91例胆管癌组织及其部分正常组织，所有患者均经病理诊断为胆管癌，术前均未接受放、化疗或其他抗肿瘤辅助治疗，收集其性别、年龄、肿瘤直径、病理分级、远处转移、T分期、AJCC第7版TNM分期等临床病理资料。患者手术时间为2011年12月至2016年8月，随访时间截至2017年5月，除去失访和芯点不完整的病例，共有88例患者可纳入研究。本研究获得医院伦理委员会批准,并与患者或家属签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学染色 采用EnVisionTM免疫组织化学染色法：将石蜡组织芯片90℃烘片4 h后，依次进行二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修复，室温下过氧化氢溶液浸泡30 min，3%牛血清蛋白(BSA)37℃封闭30 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后滴加一抗(兔抗人AIM2单抗，1∶150稀释)，4℃冰箱过夜孵育。第二天取出芯片用PBS溶液洗涤3次，每次5 min，甩净表面液体后，加辣根过氧化物酶(HRP)标记鼠/兔通用型二抗覆盖芯片，37℃温箱孵育30 min，PBS洗涤后加二氨基联苯胺(DAB)显色剂显色，冲洗后用苏木素复染，冷水缸返蓝10 min，梯度乙醇脱水干燥，风干后中性树胶封片。

1.2.2染色结果判断 组织芯片染色结果由苏州大学附属第三医院资深病理医师采用H-score法进行评估，以细胞质中出现棕黄色颗粒状物为AIM2阳性染色。H-score=(弱着色的肿瘤细胞百分比×1)+(中度着色的肿瘤细胞百分比×2)+(强着色的肿瘤细胞百分比×3)。

1.3统计学方法 用Wilcoxon秩和检验比较配对资料间差异，Pearson方差检验比较样本率差异。生存分析采用Kaplan-Meier法，并拟合Cox回归分析模型，用风险比(HR)及95%置信区间(CI)估计AIM2表达水平与胆管癌患者死亡风险的关联强度。应用SAS9.4以及R语言3.6.1软件进行统计学分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1AIM2在胆管癌组织及正常组织中的表达情况 AIM2免疫组化阳性着色主要位于细胞质，在癌组织中以低表达为主，而在正常组织中以高表达为主。见图1。胆管癌中AIM2的H-score中位数为230，范围为30～300，四分位数(177.5,280)；正常组织AIM2的H-score中位数为260，范围为80～300，四分位数(205,297.5)。Wilcoxon符号秩检验表明胆管癌组织H-score显著低于正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图1 免疫组化检测AIM2在胆管癌和正常组织中的表达(×200)Fig.1 Immunohistochemistry was used to detect expr-ession of AIM2 in cholangiocarcinoma and normal tissues(×200)

图2 胆管癌及正常组织AIM2表达水平差异Fig.2 Differences in AIM2 expression between cholangiocarcinoma and normal tissuesNote:*.P<0.05.

2.2AIM2表达与患者临床病理参数之间的相关性 以H-score=250为截点值，定义H-score>250为高表达，H-score≤250为低表达。对芯片中88例胆管癌患者的病理资料进行分析，统计结果发现AIM2的表达水平与肿瘤大小(χ2=7.380,P=0.007)呈正相关，差异具有统计学意义；AIM2表达水平与患者其他临床病理特征无显著相关性。见表1。

2.3AIM2表达水平在胆管癌患者预后评估中的作用 基于TCGA数据库结果显示，AIM2高表达的胆管癌患者的总生存期优于AIM2低表达的患者。见图3。此外，结合免疫组化结果，根据组织芯片随访数据进行Kaplan-Merier生存分析显示，AIM2呈高表达水平的胆管癌患者的总存活率显著高于AIM2呈低表达水平的患者(HR=0.293, 95%CI:0.130～0.662,P=0.002)。见图4。单因素模型分析显示，在单因素模型分析中，AIM2表达(HR=0.293，95%CI:0.130～0.662，P=0.002)、年龄(HR=0.167,95%CI:0.068～0.408,P=0.000)和肿瘤大小(HR=3.038,95%CI:1.008～9.152,P=0.048)均与总生存率显著相关；多因素Cox模型分析结果显示，AIM2表达水平(HR=0.320,95%CI:0.120～0.853,P=0.023)，性别(HR=2.268,95%CI:1.019～5.044,P=0.045)和年龄(HR=0.180,95%CI:0.070～0.465,P=0.000)可作为患者预后评估的独立危险因素。见表2。

表1 AIM2表达与胆管癌患者临床病理特征的关系

Tab.1 Relationship between expression of AIM2 and clinicopathological characteristics of patients with cholangiocarcinoma

ClinicalcharacteristicsCasesAIM2 expression levelH-score≤250H-score>250χ2P valueGender1.5940.207Male453015Female432320Age1.0280.311≤42 years old1082>42 years old784533Pathology classification1.1230.570Ⅰ1275Ⅰ-Ⅱ-Ⅱ674225Ⅱ-Ⅲ-Ⅲ945Tumor size (cm)7.3800.0071)≤1.21129>1.2775126Distant metastases0.4610.497Yes593722No291613T stage2.2470.523T1633T2603624T318135T4312TNM stage3.4380.329Ⅰ835Ⅱ392316Ⅲ28208Ⅳ1376

Note:AIM2.Absent in melanoma 2.1)P<0.05,the difference was statistically significant.

图3 基于TCGA数据库的人胆管癌组织中AIM2的表达与预后的关系Fig.3 Relationship between AIM2 expression and prognosis in human CHOL tissues based on TCGA database

图4 利用组织芯片随访数据分析AIM2表达对胆管癌患者总体生存率的影响Fig.4 Influence of AIM2 expression on overall survival rate of patients with cholangiocarcinoma with follow-up data of tissue microarray

表2 胆管癌患者总生存期影响因素Cox回归分析

Tab.2 Cox regression analysis of factors influencing total survival of patients with cholangiocarcinoma

Clinical parametersUni-variateHR(95%CI)PMulti-variateHR(95%CI)PAIM2 expression level(high:low)0.293(0.130-0.662) 0.0021)0.320(0.120-0.853) 0.0231)Gender(male:female)1.511(0.662-0.712)0.2382.268(1.019-5.044) 0.0451)Age(years)(≤42:>42)0.167(0.068-0.408) 0.0001)0.180(0.070-0.465) 0.0001)Pathology classification(Ⅰ:Ⅱ:Ⅲ:Ⅳ)0.924(0.46-1.819)0.8181.222(0.594-2.514)0.586Tumor size (≤1.2 cm:>1.2 cm)3.038(1.008-9.152) 0.0481)1.162(0.320-4.219)0.820Distant metastases(yes:no)0.590(0.225-1.550)0.2840.821(0.248-2.723)0.748T stage(T1:T2:T3:T4)0.696(0.397-1.222)0.2070.917(0.363-2.317)0.855TNM stage(Ⅰ:Ⅱ:Ⅲ:Ⅳ)0.784(0.501-1.209)0.2710.927(0.465-1.849)0.830

Note:AIM2.Absent in melanoma 2；HR.Risk ratio；CI.Confidence interval.1)P<0.05，the difference was statistically significant.

3 讨论

近年来，胆管癌的发病率和死亡率在世界范围内呈上升趋势[6]。虽然在外科、化疗和放疗等方面取得了新进展，但胆管癌患者的预后仍然很差，5年生存率仅为5%～20%[7]。尽管完全性切除为胆管癌患者提供了最高的生存率，但准确的术前诊断仍然是最大的问题。AIM2基因共同存在于人和小鼠中，可作为DNA识别受体介导天然免疫应答，并且在肿瘤进展中发挥重要作用[8]。近期研究表明，AIM2与感染防御和肿瘤病理相关，在不同肿瘤组织中异常表达[9,10]。但是目前AIM2在胆管癌中的临床价值仍未得到明确的阐述，需进行实验发现更多临床依据对其进行验证。

本研究通过免疫组化及组织芯片技术检测人胆管癌组织及正常组织中AIM2的表达，结合临床数据分析。结果表明，胆管癌组织中AIM2表达水平显著低于正常组织，并且AIM2呈高表达的胆管癌患者的总存活率显著优于AIM2呈低表达水平的患者，这与最初提出的AIM2作为抑癌基因发挥肿瘤抑制作用结果一致[11]。Li等[12]研究表明，下咽鳞癌组织中的AIM2的表达水平明显低于邻近正常咽部组织(P<0.05)，且AIM2低表达水平与下咽鳞癌患者生存差密切相关(P<0.000 1)。同样，Zhang等[13]观察到AIM2正常结直肠组织中呈高表达，而在结直肠癌组织中的表达明显较低(P<0.01)，与结直肠癌的预后不良相关，是结直肠癌患者总生存率的独立预后因素，可作为结直肠癌潜在的诊断和预后生物标志物。武少贤等[14]研究亦表明AIM2表达在胆管癌组织中较正常组织降低。本实验进一步评估了AIM2表达水平的临床相关性，结果显示，AIM2的表达水平与肿瘤大小明显相关，与其他临床病理特征均无显著相关性，提示AIM2低表达可能与胆管癌的进展有关。Chai等[15]研究表明AIM2通过增强自噬的诱导作用来抑制肾癌的肿瘤进展，上调AIM2可能成为肾癌治疗的新方法。另有研究发现，乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)引起的AIM2缺失与肝癌患者不良预后相关，并通过触发上皮-间质转化(EMT)过程促进肝癌转移，表明AIM2是乙型肝炎病毒相关性肝癌的潜在预后生物标志物，也是肿瘤转移的可能治疗靶标[16]。本实验还通过单因素模型分析显示，肿瘤较大的患者总生存期(OS)较肿瘤较小的患者OS显著缩短，AIM2低表达的患者OS较AIM2高表达的患者OS显著缩短。此外，多因素Cox风险比例模型显示，患者AIM2表达水平、性别及年龄均可作为其预后预测的独立危险因素。本研究除了具有重要的意义外，还存在一些潜在的局限性。例如，没有通过进行体外研究在AIM2基因敲低或上调情况下的人源性胆管癌细胞增殖、杀伤以及迁移功能变化。因此， AIM2在CRC进展中的作用及其作用机制尚需进一步研究。

综上所述，AIM2在胆管癌进展中表达下调,可作为胆管癌患者预后的独立危险因素，有望成为胆管癌诊疗的潜在靶点。但目前关于AIM2在胆管癌中分子作用机制的研究较少。因此，进一步研究AIM2在胆管癌进展中如何发挥作用具有重要的临床意义。