茯苓酸通过上调miR-133a影响子宫肌瘤细胞增殖凋亡及表皮生长因子的水平

王 佳 梁葵香 刘艳妮 杨延冬 (滨州医学院附属医院妇产科，滨州 256603)

子宫肌瘤是育龄期妇女中常见的一种盆腔肿瘤，其临床表现主要为月经过多、习惯性流产等，发生率逐年升高[1]。研究表明子宫肌瘤细胞增殖、凋亡与子宫肌瘤的发生及发展密切相关[2]。因而基于子宫肌瘤发病机制研发治疗该疾病的有效药物具有重要意义。相关报道指出茯苓具有活血化瘀的功效并可用于治疗子宫肌瘤、慢性盆腔炎、子宫内膜异位等妇科疾病，但具体作用机制尚未可知[3,4]。研究表明茯苓酸(pachymic acid，PA)是中药茯苓的有效成分，具有抗炎、抗肿瘤等作用，并可通过抑制肿瘤细胞增殖、迁移等生物学过程发挥抗癌作用[5]。但PA对子宫肌瘤抑制作用的研究尚未见报道。微小RNA-133a(microRNA-133a，miR-133a)在结直肠癌细胞中呈低表达，上调miR-133a的表达可抑制结直肠癌细胞迁移及侵袭[6]。但PA是否能够通过调控miR-133a的表达从而影响子宫肌瘤发生发展过程尚未可知。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophage，TAM)分泌的表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)可通过促进表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)表达从而促进上皮性卵巢癌转移[7]。本研究采用PA作用于子宫肌瘤细胞，探究其在体外抑制子宫肌瘤细胞增殖及诱导凋亡的作用机制，分析其对miR-133a表达的调控作用及其对EGF水平的影响，为PA在子宫肌瘤治疗方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1材料与试剂 PA购自上海晶都生物技术有限公司；DMEM培养基购自美国Thermo Fisher公司；胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)购自美国依科赛生物公司；蛋白提取试剂盒均购自陕西碧云天生物工程有限公司；二 喹 啉 甲 酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量检测试剂盒购自美国Pierce公司；miR-133a模拟物(miR-133a mimics)及阴性对照(miR-NC)、miR-133a特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-133a)及阴性对照(anti-miR-NC)购自广州锐博生物科技有限公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)购自武汉艾美捷科技有限公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡试剂盒购自上海润成生物科技有限公司；EGF酶联免疫吸附检测试剂盒购自上海信裕生物科技有限公司；Trizol试剂、反转录与荧光定量PCR试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；兔抗人EGFR、CyclinD1、C-caspase-3抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.1.2研究对象 收集2016年4月至2017年4月病理证实为子宫肌瘤的手术切除标本58例，所有患者均经病理证实为子宫肌瘤；患者术前均未进行放疗或化疗等治疗。患者年龄35～60岁，平均年龄(48.58±8.79)岁，病程2～6年，平均(3.56±1.03)年，子宫肌瘤组织平均体积(168.35±45.87)cm3。

1.1.3纳入标准 术中切除离体的宫颈标本置于无RNA酶的EP管内，放入液氮中，术后转移至-80℃超低温冰箱保存。

1.2方法

1.2.1子宫肌瘤细胞原代培养 子宫肌瘤组织置于含有双抗的PBS中培养5 min，剪碎组织，加入Ⅰ型胶原酶，37℃恒温浴锅内消化3 h，待组织块变小后加入完全培养基终止消化，采用200目细胞筛过滤收集，4℃下1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入新鲜完全培养基，置于37℃、5%CO2培养箱内培养24 h，每隔2 d更换一次培养液，待细胞融合度达到80%时进行传代培养。子宫肌瘤细胞贴壁生长，分离子宫肌瘤细胞，采用免疫细胞化学法染色鉴定子宫肌瘤细胞，取对数生长期细胞进行后续研究[8]。

1.2.2实验处理与分组 取对数生长期子宫肌瘤细胞，采用含有10% FBS的DMEM培养基置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内进行培养，用不同浓度的PA(10、20、40、80 μg/ml)处理子宫肌瘤细胞24 h，分别命名为PA 10 μg/ml组、PA 20 μg/ml组、PA 40 μg/ml组、PA 80 μg/ml组[9]。正常培养基培养的子宫肌瘤细胞命名为NC组。MTT实验检测各组细胞存活率，选用存活率为50%左右的PA浓度用于后续研究。观察miR-133a过表达对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡及EGF的影响，实验分为miR-NC组(miR-NC转染至子宫肌瘤细胞)、miR-133a组(miR-133a mimics转染至子宫肌瘤细胞)。后续研究为验证PA是否通过调控miR-133a的表达而发挥作用，实验分为PA+anti-miR-NC组(anti-miR-NC转染至子宫肌瘤细胞48 h，含有40 μg/ml PA的培养基培养24 h)、PA+anti-miR-133a组(anti-miR-133a转染至子宫肌瘤细胞48 h，含有40 μg/ml PA的培养基培养24 h)。

1.2.3MTT检测细胞增殖 取对数生长期子宫肌瘤细胞接种于96孔板(1.0×104个/孔)，弃上清液，按照“1.2.2”药物处理方法进行分组，每组设置3个复孔，置于培养箱内继续培养24 h后，每孔加入MTT溶液20 μl(质量浓度为5 mg/ml)，室温孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，微量振荡器中持续振荡10 min，于490 nm波长处测定吸光度值(OD值)，细胞存活率(%)=(各实验组OD值-空白对照组OD值)/(正常对照组OD值-空白对照组OD值)×100%。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡率 收集各组子宫肌瘤细胞，预冷PBS清洗，4℃下1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入PBS，4℃下1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入500 μl Binding Buffer重悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC混匀，室温避光孵育15 min，于1 h内置于流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5qRT-PCR检测细胞中miR-133a的表达水平 采用Trizol法提取子宫肌瘤细胞RNA，应用Nanodrop 2000c超微量分光光度计检测RNA浓度，RNA OD260/OD280值处于1.8～2.0，反转录合成cDNA，miR-133a正向引物5′-TTTGGTCCCCTT-CAAC-3′，反向引物：5′-TAGCTATCCTTTGCT-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。PCR扩增：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环。miR-133a以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-133a相对表达量。

1.2.6Western blot检测CyclinD1、EGFR、C-caspase-3蛋白表达 收集各组子宫肌瘤细胞，加入蛋白裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，采用SDS-PAGE电泳分离蛋白，将分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入CyclinD1(1∶1 000)、EGFR(1∶1 000)、C-caspase-3(1∶500)一抗，4℃孵育24 h，TBST洗涤，加入二抗(1∶2 000)，室温孵育1 h，TBST洗涤，滴加ECL化学发光剂，暗室内曝光显影，Image J软件分析各条带灰度值。

1.2.7ELISA法检测EGF水平 收集各组细胞的培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，检测各组细胞培养上清液中EGF水平。

2 结果

2.1不同浓度PA对子宫肌瘤细胞增殖的影响 实验结果显示，与NC组相比，PA 10 μg/ml组、PA 20 μg/ml组、PA 40 μg/ml组、PA 80 μg/ml组子宫肌瘤细胞的细胞存活率均显著降低(P<0.05)，其中PA 40 μg/ml组细胞存活率为50%左右，因而选用PA 40 μg/ml作为后续研究，见图1。

2.2PA对子宫肌瘤细胞凋亡和EGF的影响 相对于NC组，PA组子宫肌瘤细胞的细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，C-caspase-3蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)，EGFR蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)，而EGF水平显著降低(P<0.05)，见图2。

2.3PA对miR-133a表达的影响 与NC组比较，PA组子宫肌瘤细胞中miR-133a的表达水平显著升高(P<0.05)，见图3。

2.4高表达miR-133a对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡及EGF的影响 实验结果显示，与miR-NC组比较，miR-133a组子宫肌瘤细胞中miR-133a的表达水平显著升高(P<0.05)，miR-133a的表达上调成功。相对于miR-NC组，miR-133a组子宫肌瘤细胞的细胞存活率显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，CyclinD1、EGFR蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)，C-caspase-3蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)，EGF水平显著降低(P<0.05)，见图4。

图1 不同浓度PA对子宫肌瘤细胞增殖的影响Fig.1 Effect of different concentrations of PA on proliferation of uterine fibroid cellsNote:Compared with NC group,*.P<0.05.

图2 PA对子宫肌瘤细胞凋亡和EGF的影响Fig.2 Effect of PA on uterine fibroid cell apoptosis and EGFNote:A.Detection of apoptosis by flow cytometry;B,C.Western blot detection of C-caspase-3 and EGFR protein expression；D.Detection level of EGF；compared with NC group,*.P<0.05.

图3 PA对miR-133a表达的影响Fig.3 Effect of PA on the expression of miR-133aNote:Compared with NC group,*.P<0.05.

2.5低表达miR-133a可部分逆转PA对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡及EGF的影响 与PA+anti-miR-NC组比较，PA+anti-miR-133a组子宫肌瘤细胞中miR-133a的表达水平显著降低(P<0.05)，细胞存活率显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，CyclinD1、EGFR蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)，而C-caspase-3蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)，EGF水平显著升高(P<0.05)，见图5。

图4 高表达miR-133a对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡及EGF的影响Fig.4 Effect of overexpressing miR-133a on uterine fibroid cell proliferation,apoptosis and EGFNote:A.qRT-PCR detection of miR-133a expression level；B.Cell survival rate detected by MTT；C.Detection of apoptosis by flow cytometry;D，E.Western blot for CyclinD1,C-caspase-3,and EGFR protein expression；F.EGF level.Compared with miR-NC group,*.P<0.05.

图5 低表达miR-133a可部分逆转PA对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡及EGF的影响Fig.5 Low expression of miR-133a can partially reverse PA′s effects on uterine fibroid cell proliferation,apoptosis and EGFNote:A.qRT-PCR detection of miR-133a expression level；B.Cell survival rate detected by MTT；C.Detection of apoptosis by flow cytometry;D，E.Western blot for CyclinD1,C-caspase-3,and EGFR protein expression；F.EGF level.Compared with PA +anti-miR-NC group,*.P<0.05.

3 讨论

子宫肌瘤已严重威胁女性身体健康，近年来，随着生活节奏的加快，子宫肌瘤发病率逐年升高，目前主要采用药物治疗与手术治疗，激素类药物可通过调控内分泌从而达到治疗效果，但副作用较大[10-12]。因而寻找安全有效又可最大程度保留子宫的治疗方法或治疗药物成为研究重点。本研究通过分析PA对子宫肌瘤细胞增殖及凋亡的影响，为临床用药奠定理论基础。

PA具有抗肿瘤作用，研究表明PA可通过抑制磷脂酰肌醇转移蛋白的磷酸化从而抑制乳腺癌细胞转移，或通过抑制蛋白激酶B(Akt)的表达而抑制胆囊癌细胞增殖、迁移及侵袭,以及通过抑制Wnt信号通路激活而抑制肾癌细胞增殖及诱导细胞凋亡[13-15]。但PA对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡的影响尚未可知。本研究结果显示不同浓度的PA处理子宫肌瘤细胞后，细胞存活率显著降低，提示PA可抑制子宫肌瘤细胞增殖。有研究表明C-caspase-3蛋白表达水平升高可促进子宫肌瘤细胞凋亡[16]。本研究结果显示PA可促进子宫肌瘤细胞凋亡，提高C-caspase-3蛋白表达水平，提示PA可能通过上调C-caspase-3的表达而诱导子宫肌瘤细胞凋亡。肿瘤环境中巨噬细胞可被诱导为M2型巨噬细胞(TAM)，研究表明TAM可促进EGF的生成进而促进肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭，EGF可激活EGFR从而促进肿瘤恶性增殖、血管生成及细胞迁移等过程[17-19]。本研究结果显示PA可降低EGF、EGFR的表达水平，提示PA可能通过抑制EGF生成从而降低EGFR的表达水平进而抑制子宫肌瘤细胞增殖及促进肿瘤细胞凋亡。

miR-133a在肿瘤中呈低表达，上调miR-133a的表达可抑制肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭[20]。研究表明姜黄素可通过上调miR-133a的表达从而抑制肝癌细胞迁移及侵袭[21]。本研究结果显示PA处理后，子宫肌瘤细胞中miR-133a的表达水平显著升高，提示PA可能通过促进miR-133a的表达从而抑制子宫肌瘤细胞增殖及促进肿瘤细胞凋亡。同时本研究结果显示miR-133a过表达后子宫肌瘤细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高，CyclinD1、EGFR、EGF表达水平均显著降低，C-caspase-3蛋白表达水平显著升高。研究表明CyclinD1可促进细胞周期由G1期进入S期，在多种肿瘤细胞中呈高表达，促进细胞恶性增殖[22]。本研究结果显示miR-133a过表达可调控细胞增殖及凋亡及相关蛋白表达，影响EGF水平，抑制miR-133a表达可逆转PA对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡及EGF的影响。

综上所述，PA可通过上调miR-133a的表达从而减弱子宫肌瘤细胞增殖能力，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制EGF表达，因此，PA可能成为子宫肌瘤潜在治疗药物。