“下一代”CAR T细胞在实体瘤治疗中的研究进展①

田永贵 张 毅 (郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心，郑州 450052)

以嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞为代表的细胞免疫治疗手段在肿瘤治疗中已经取得革命性的进展。CAR T细胞是经过基因改造以表达CAR的自体或异体T细胞。CAR是融合蛋白，包含识别抗原的单链可变区(single chain fragment variable,scFv)、跨膜区和胞内信号区(共刺激信号和CD3ζ)。与TCR不同，CAR以非MHC限制的方式特异性识别肿瘤细胞上的抗原[1]。CAR T细胞历经四代，已取得了显著性的进展。第一代CAR仅包含一个胞内信号传导域CD3ζ。第二代和第三代CAR是在第一代CAR的基础上分别加入一个或两个共刺激信号域(例如CD28、OX40和4-1BB)来构建[2]。第四代CAR则是进一步引入功能性细胞因子来增强T细胞的杀伤和扩增能力。

2017年，CD19 CAR T细胞获得了美国FDA批准用于白血病和淋巴瘤的治疗。至此，CAR T细胞已经在B细胞恶性肿瘤中发挥了显著疗效，彻底改变了肿瘤免疫治疗领域。然而，由于实体瘤的免疫抑制性微环境和抗原异质性，CAR T细胞在实体瘤的治疗中效果欠佳[3]。Lim和June[4]总结了CAR T细胞治疗的五个主要挑战，包括肿瘤抗原的异质性、CAR T细胞浸润不足、增殖和持久性差、毒性控制以及免疫抑制性的微环境。这些问题都急需“下一代”CAR 的结构改造来进一步提高实体瘤的治疗效果。基因工程技术的发展为CAR T细胞的改造提供了多种途径，通过靶向多种抗原、过表达细胞因子或者趋化因子受体、增强共刺激信号和消除抑制因子等以达到增强CAR T细胞功效的目的(图1)。目前，这些“下一代”CAR T细胞已在临床前模型中显示出令人鼓舞的结果，在实体瘤的治疗中发挥潜力。

1 提高CAR T细胞的抗原识别能力

CAR T细胞通过识别特异性抗原来靶向肿瘤，抗原的识别是CAR T细胞发挥疗效的前提。为了避免免疫逃逸，并提高安全性，选择在肿瘤组织中特异性高表达的肿瘤相关抗原作为CAR T细胞的靶点[5,6]。肿瘤相关抗原分为5个类型：分化抗原、过表达抗原、癌睾抗原(黑色素瘤抗原，MAGE家族)、病毒抗原(HPV、EBV、HBV等)和肿瘤新生抗原(突变抗原)。与血液肿瘤相比，实体瘤存在抗原异质性表达的特点。CAR T细胞优先杀伤高表达靶向抗原的肿瘤细胞，但是可能无法消除较低抗原密度的细胞[7]。多种研究数据表明，CAR T细胞的治疗会导致靶向抗原的下调，这是导致肿瘤复发的原因之一[8]。

图1 基因工程改造“下一代”CAR T细胞的方法Fig.1 Genetically engineered strategies for "Next Generation" CAR T cellsNote:"Next Generation" CAR T cells enhance potent antitumor properties by gene-editing technology.Multi-target CAR T cells improve antigen recognition and reduce immune escape.CAR T cells equipped with chemokine receptors overcome their poor trafficking to tumor sites.Optimizing costimulatory signals and overexpressing cytokines enhance CAR T cell proliferation and persistence.In addition,manipulating negative regulators in CAR T cells helps to regain the effector response.

研究证实，靶向单个抗原的CAR T细胞造成抗原阴性细胞的生长，为了解决这种问题，研究者开发了靶向两种或者多种不同肿瘤相关抗原的CAR T细胞，以提高其对抗原的识别能力，增加疗效和安全性，降低肿瘤逃逸的风险[3]。Hegde等[9]设计了一种双靶点CAR T细胞，他们将HER2抗体的单链可变区(scFv)与IL-13Rα2结合的IL-13突变蛋白连接在一起，形成串联型CAR(TanCAR)胞外域，这种双特异性TanCAR T细胞共同识别HER2和IL13Rα2。同单靶点CAR T细胞相比，TanCAR T细胞显示出更好的活化能力，且持久性增加。在胶质母细胞瘤小鼠模型中，TanCAR T细胞抗肿瘤活性功能较强，降低抗原逃逸的发生概率，从而显著延长了小鼠的生存期[9]。采用类似的方法，Bielamowicz等[10]构建了靶向HER2、IL13Rα2和 EphA2三种抗原的三靶点CAR T(Trivalent CAR T)细胞。这种三靶点CAR T细胞比双靶点细胞更有效，克服了胶质母细胞瘤的抗原异质性所导致的免疫逃逸并改善了治疗效果。同时靶向CD19和CD22的CAR T细胞治疗复发和难治性B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患者，使其达到长期缓解的状态[11]。除CD22外，正在研究的共同靶点还有CD20、CD123和CD133[12-14]。此外，上调肿瘤相关抗原的表达同样可以提高CAR T细胞的识别能力。Mei等[15]研究发现外源添加IL-22可以增加靶点MUC1的表达，因此，构建了表达IL-22的MUC1 CAR T细胞，这种改造的CAR T细胞对MUC1+头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)细胞的识别能力增强，且能更有效地控制肿瘤生长。

Bielamowicz等研究结果显示，与单靶点和双靶点CAR T细胞相比，三靶点CAR T细胞表现出更高的细胞毒性和更强的细胞因子释放能力[9,10]。同时，多种靶点的结合增加了CAR T细胞的潜在脱靶效应。因此，多靶点CAR T细胞的结构设计及其安全性仍需进一步研究。

2 增加CAR T细胞在肿瘤部位的浸润

CAR T细胞必须迁移至肿瘤部位才能有效控制肿瘤的生长。在血液肿瘤中，CAR T细胞在血液中即可杀伤肿瘤细胞。但是在实体瘤中，肿瘤微环境的低氧、纤维化、丰富的血管和细胞外基质等多种特点，造成CAR T细胞无法有效归巢至肿瘤部位，这是实体瘤中CAR T细胞疗效欠佳的一个重要因素[16]。肿瘤微环境中淋巴细胞浸润的增加与各种肿瘤的良好预后密切相关[17]。目前，大量的研究致力于将低或无免疫原性的“冷肿瘤”转变为有免疫原性的“热肿瘤”[18]。

趋化因子与其受体的相互作用可以促进T细胞的迁移。CAR T细胞中过表达趋化因子受体，可以增加其向高表达同源配体的肿瘤部位迁移。Jin等[19]构建了表达IL-8受体CXCR1或者CXCR2的CAR T(8R70CAR T)细胞。在胶质母细胞瘤，卵巢癌和胰腺癌的临床前模型中，8R70CAR T细胞显著增强了肿瘤中T细胞的浸润和持久性，诱导了肿瘤的完全消退。Craddock等[20]和Moon等[21]分别在神经母细胞瘤和恶性胸膜间皮瘤中研究过表达CCR2(CCL2的受体)的CAR T(CCR2-CAR T)细胞的功能，结果显示CCR2-CAR T细胞的归巢能力和抗肿瘤活性均显著增强。此外，在霍奇金肿瘤中过表达CCR4的CD30-CAR T细胞增强了其对分泌CCL17和CCL22(CCR4的配体)的Reed-Stemberg细胞的归巢[22]。最近，Adachi等[23]构建了7×19 CAR T(同时表达IL-7和CCL19的CAR T细胞)，这种表达趋化因子的CAR T细胞招募宿主体内的DC和T细胞迁移至肿瘤部位，显著增强了抗肿瘤功效。

确定合适的趋化因子-趋化因子受体轴是至关重要的，这需要大量工作来寻找肿瘤中高表达的特定趋化因子，并在CAR T细胞上过表达相应的受体。表达趋化因子受体的CAR T细胞可以增加其在肿瘤部位的浸润，但是趋化因子的非特异性可能将T细胞募至其他位点，产生新的毒性。因此，未来需要从安全性的角度来研究这类CAR T细胞的改造以规避这种风险。

3 提高CAR T细胞的增殖和持久性

T细胞的增殖和持久性是CAR T细胞临床疗效的关键预测指标。CAR T细胞在归巢至肿瘤部位后，必须要经历扩增达到相对于肿瘤负荷的适当数量，才能在体内消除肿瘤。大量的CAR T细胞疗法的临床试验报道了体内回输T细胞的持久性较差，特别是在实体瘤中[5]，如何确保体内CAR T 细胞的扩增数量并持续更长时间来杀伤肿瘤细胞，是当前CAR T细胞研究的重点。

3.1共刺激信号的加入及优化 CAR的结构可以影响T细胞的增殖和持久性。第一代CAR T细胞在肿瘤患者体内的持久性不佳，第二代CAR T细胞的CAR结构增加了一个共刺激域，大大增强了T细胞的持久性和抗肿瘤作用[24]。作为CAR结构中广泛应用的两个共刺激域，CD28和4-1BB对T细胞有不同的影响。当以CD28为共刺激分子时，CAR T细胞显示出更高的初始抗肿瘤能力，糖酵解和细胞因子的产生增加，而以4-1BB为共刺激分子的CAR T细胞显著增加记忆性T细胞的扩增，氧化磷酸化代谢增加，持久性更高[25,26]。除了已知的共刺激分子以外，其他共刺激信号的加入同样可以增加CAR T细胞的增殖和持久性。Lai等[27]将TLR2信号引入CAR T细胞，TLR2信号增强了CAR T细胞的增殖，并降低共刺激信号的激活阈值。NKG2D是T细胞的共刺激受体，其信号转导依赖于DNAX激活蛋白10(DAP10)。Zhao等[28]将DAP10的胞内域引入到第二代CAR M28z中，生成了靶向间皮素的M28z10 T细胞。DAP10的加入促进细胞因子的产生和记忆性T细胞的形成，CAR T细胞的持久性增加。

3.2增加T细胞活化的第3信号的表达 CAR T细胞的活化和增殖不仅需要CD3ζ和共刺激域(信号1和2)，还需要细胞因子的刺激(信号3)，而在肿瘤微环境中这些细胞因子表达能力下调。因此，可以构建细胞因子过表达的CAR T细胞以提供信号3促进CAR T细胞的活化和增殖。多种研究表明，过表达IL-7、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21可以促进CAR T细胞的活性[23，29-32]。然而，这些细胞因子的表达可能会导致毒性的增加。为了解决这一问题，Shum等[33]构建了一个表达IL-7细胞因子受体(C7R)的CAR T细胞，C7R是一个组成型信号传导的受体，不需要外源细胞因子的参与，即可激活下游的STAT5。共表达C7R的CAR T细胞增加了T细胞增殖和存活，增强了抗肿瘤活性。JAK/STAT信号激活由γc家族细胞因子(如IL-7、IL-15和IL-21)介导，因此，Kagoya等[34]开发了一种新型的CAR构建体，将被截短的IL-2Rβ胞内结构域和结合STAT3的YXXQ基序整合到共同刺激域中，称为28-IL2RB-z(YXXQ)CAR，这种CAR T细胞在抗原结合后激活JAK/STAT信号传导，表现出优异的增殖能力，促进记忆性T细胞的分化和维持。

4 克服CAR T细胞的功能障碍

在实体瘤中，CAR T细胞归巢至肿瘤部位不足以达到预期的临床疗效。肿瘤的免疫抑制性微环境和T细胞的内在因素导致CAR T细胞的效应功能逐步丧失，功能障碍的CAR T细胞无法杀伤肿瘤细胞[35]。T细胞的功能受多种因素的调节，例如免疫检查点分子，抑制性细胞因子，转录因子，代谢分子和凋亡基因等[36]。目前，越来越多的研究集中在调节这些因素以克服CAR T细胞的功能障碍(T细胞无能、耗竭、衰老和凋亡)，增强CAR T细胞的功效。

4.1免疫检查点分子 CAR T细胞受到肿瘤微环境中抑制性免疫检查点信号的干扰，例如PD-1、CTLA-4、LAG3，这些信号的表达抑制了T细胞的杀伤功能，最终导致免疫逃逸。为了解决这种现象，多种强大的基因编辑技术(CRISPR/Cas9、TALEN和AAV-Cpf1)被用于敲除免疫检查点分子以逆转CAR T细胞的耗竭表型，改善其抗肿瘤功能[37-40]。大量研究表明，PD-1的敲除增加了CAR T细胞浸润和持久性，增强了肿瘤清除率，并预防复发[38,41-45]。类似地，LAG3或CTLA-4的缺失同样可以改善CAR T细胞功能[39,40]。最近，Ren等[46]设计了一种可以进行多基因编辑的快速有效的CRISPR系统(one-shot CRISPR protocol)，可同时敲除HLA-Ⅰ、TCR、PD-1和CTLA-4四种基因，以产生PD-1和CTLA-4同时缺失的通用型CAR T细胞，这可能会增强CAR T细胞的功能。但是，gRNA竞争以及慢病毒的包装尺寸的限制导致CAR T细胞的转染效率大大降低。

除了敲除免疫检查点，显性负受体(dominant negative receptor,DNR)和嵌合开关受体(chimeric switch receptor,CSR)也是克服肿瘤免疫抑制的途径。PD-1 DNR敲除了PD-1的跨膜区和胞内域，只保留胞外结合域。这种改造增强了CAR T细胞分泌细胞因子的能力和细胞毒性，显示出了更有效的肿瘤控制能力[47]。CSR将免疫检查点分子的胞内信号域转换为胞内共刺激域，逆转CAR T细胞中免疫检查点的抑制作用，将抑制信号转化为激活信号。研究证实，具有PD-1/CD28的CAR T细胞其耐受性更强，且显著提高抗肿瘤活性[48]。CTLA-4/CD28改造的T细胞也发挥了类似的作用[49]。

4.2抑制性细胞因子 肿瘤微环境还富含免疫抑制性细胞因子。TGF-β有抑制免疫细胞的功能，为肿瘤的生长和转移提供有利的微环境。为了消除TGF-β对CAR T细胞的抑制作用，Kloss等[50]和Zhang等[51]设计了TGF-βⅡ型的显性负受体(dnTGF-βRⅡ)，CAR T细胞表达dnTGF-βRⅡ后，在小鼠模型中观察到这些CAR T细胞的增殖增加，细胞因子分泌和体内持久性增强，延长了小鼠的生存期。IL-4在多种实体瘤中表达水平升高，在促进肿瘤进展中起关键作用。研究者构建了IL-4受体的CSR，将IL-4受体的胞内域转化为IL-7受体胞内域(4/7 ICR)或IL-21受体胞内域(4/21 ICR)。当IL-4刺激及抗原识别后，4/7 ICR或4/21 ICR改造的CAR T细胞表现出强的裂解能力和增殖潜能[52,53]。

4.3转录因子 转录因子在T细胞功能调节中发挥重要的作用。核受体转录因子NR4A家族包括NR4A1、NR4A2和NR4A3。肿瘤微环境中T细胞PD-1和TIM3的表达与NR4A受体的激活相关[54]。Chen等[55]将CAR T细胞中的3个NR4A同时敲除，NR4A缺失的CAR T细胞显示PD-1和TIM3表达水平的下调，并延长了荷瘤小鼠的生存期。最近，研究表明编码高迁移率族框蛋白的转录因子TOX是T细胞衰竭的关键转录调节因子。Seo等[56]发现TOX和TOX2在耗竭表型的CAR T细胞中高表达。TOX和TOX2双重敲除的CAR T细胞抑制性受体表达减少，细胞因子产生增加，显示出了优于TOX-/-或TOX2-/-CAR T细胞的抗肿瘤能力。

4.4其他分子 CAR T细胞代谢分子及凋亡基因的改造为克服T细胞的功能障碍提供了另一种策略。二酰基甘油激酶(DGK)是一类分解二酰基甘油(DAG)的酶，有三种同工型，分别是DGKα、DGKδ和DGKζ。DGK的激活可导致TCR下游分子的下调，可能成为肿瘤治疗的潜在靶标[57]。Jung等[58]使用CRISPR/Cas9介导CAR T细胞中DGKα和DGKζ的双敲除(DGK dKO CAR T)，DGK的缺失增加了TCR信号传导，增强CAR T细胞效应功能，并显著诱导胶质母细胞瘤的消退。Fas受体通过与配体(FasL)结合而诱导凋亡。Ren等[46]对CAR T细胞进行了TCR、HLA-Ⅰ和Fas的三重基因敲除。Fas消融的CAR T细胞具有抗凋亡作用，并增强了CAR T细胞的肿瘤控制能力。

5 挑战与展望

CD19 CAR T细胞在B细胞淋巴瘤的患者治疗中显示出空前的临床成功，这证明了CAR T细胞在抗肿瘤治疗中的巨大潜力。相比之下，CAR T细胞治疗实体瘤的临床疗效却不尽人意。肿瘤微环境和T细胞的内在因素是导致CAR T细胞疗效欠佳的主要原因。研究者运用基因工程技术改造CAR T细胞以突破这些障碍增加CAR T细胞功能。靶向多种肿瘤相关抗原提高CAR T细胞的识别能力，减少免疫逃逸。过表达趋化因子受体或趋化因子的CAR T细胞增加了免疫细胞在肿瘤部位的聚集，是CAR T细胞杀伤肿瘤的前提。共刺激信号或T细胞活化信号3的增加(细胞因子，细胞因子受体或其下游途径的基因表达)实现了CAR T细胞的最佳激活，增殖和持久性。敲除或者逆转T细胞抑制性因子来克服CAR T细胞的功能障碍，增强抗肿瘤能力。这些改造的CAR T细胞表现出了优于常规CAR T细胞的抗肿瘤能力。迄今为止，对CAR T细胞的研究更多地集中在增强其功能上，但是，在几乎所有的临床试验中，都有不良反应(例如细胞因子释放综合征和神经毒性)，有些可能是致命的。随着CAR T细胞的改造，不良反应可能会增加，因此，CAR T细胞的毒性控制是一个不可忽略的问题。此外，目前各种改造策略均表现出控制肿瘤生长的能力，哪种策略或者改造组合是最有效的，仍然需要大量的临床前模型去检测。尽管如此，“下一代” CAR T细胞显示的优越的抗肿瘤能力仍然给肿瘤患者带来了曙光，为我们之后的研究指引了方向。