牛磺酸调节白介素水平对椎间盘退变大鼠模型髓核细胞凋亡、炎症和氧化应激的保护作用

史 锐 朱振军 杨永波 (新乡中心医院骨科，新乡 453000)

随着人口老龄化不断加重，下腰痛已成为很普遍的健康隐患，给患者家庭和社会造成了沉重的负担[1]。椎间盘是机体完成脊柱运动、负重和柔韧性能的基础，但易受损伤而发生形态学改变，包括年龄、损伤等因素[2]，椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IDD)是临床引起下腰痛的主要原因，其治疗包括保守治疗、椎间盘切除和脊柱融合，但均不能从根本上阻止其退变[3,4]。研究表明，炎症微环境和新的神经支配产生是椎间盘性疼痛的来源，包括IL-1β在内的许多炎症因子分泌增加都会促进椎间盘退变；同时，IL-1β还能影响椎间盘细胞衰老、自噬和与增殖、再生有关的基因表达[5,6]。因此，抑制IL-1β可能是预防和逆转椎间盘退变的重要治疗靶点。牛磺酸(taurine)，又名2-氨基-乙磺酸，因首次分离自牛的胆汁而得名，大量研究表明，牛磺酸是具有抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡和神经保护功能的游离的细胞内β氨基酸[7-9]。但关于牛磺酸对髓核细胞炎症、凋亡和氧化应激的影响鲜少报道，基于此本文采用原代培养的大鼠髓核细胞，以IL-1β诱导建立椎间盘退变大鼠髓核细胞模型，探究牛磺酸对椎间盘退变大鼠髓核细胞模型细胞凋亡、炎症和氧化应激的作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 SD大鼠购自维通利华公司；Ⅱ型胶原酶购自美国Biosharp公司；Hochest33342凋亡检测试剂盒(Solarbio 公司)；DMEM/F12培养液，青霉素、链霉素双抗，0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司；IL-1β、牛磺酸购自Sigma公司；总RNA 提取试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；胎牛血清购自Hyclone公司；甲苯胺蓝试剂盒购自Baso公司；番红O试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司；RT-PCR试剂购自TransGen公司；倒置相差显微镜购自 Nikon公司；6 孔培养板、24 孔培养板购自Corning公司；净化工作台购自苏州净化设备有限公司；PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；CO2细胞培养箱、凝胶自动成像系统购自SIM公司；高速冷冻离心机购自美国Eppendorf公司；Caspase-3、Caspase-9、GAPDH引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；隔水式恒温孵育箱、电子天平、全自动酶标洗板机、酶标仪、恒温振荡器及普通手术器械等购自上海知信实验仪器技术有限公司。

1.2方法

1.2.1髓核细胞分离培养[10,11]健康成年SD大鼠5只，体重(200±20)g，采用CO2麻醉致死法处死大鼠。将其放入75%酒精浸泡对体表进行消毒，再移入净化工作台内，在无菌条件下分离胸腰段脊柱，再仔细剥离脊柱周围多余的肌肉组织，使椎间盘充分暴露，最后小心划开纤维环获取白色凝胶样髓核组织。将获得的组织用PBS液反复洗涤，以去除破碎的其他组织及血渍，再将其切成约1 mm3的小碎块，移入灭菌离心管中，用0.1% Ⅱ 型胶原酶将其淹没。在37℃恒温振荡器中振荡消化0.5 h，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用PBS液离心漂洗3次，弃离心液备用。再用0.1% Ⅱ 型胶原酶重悬离心后的组织块，在37℃、5%CO2条件下孵育4 h，最后将上述细胞悬液用 70 μm孔径的细胞筛网过滤。将得到的细胞用DMEM/F-12离心洗涤3次，转入25 cm2细胞培养瓶中，加入含1%青-链霉素和10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。4～5 d 后首次换液，去除漂浮组织块，以后每3 d换液一次，当细胞融合率达到85%时可进行传代。倒置相差显微镜观察每代细胞形态，第2代细胞用于细胞鉴定，第3代细胞进行后续实验。

1.2.2细胞鉴定及形态学观察 采用番红染色和甲苯胺蓝染色鉴定髓核细胞。将第2 代细胞接种于24 孔板，细胞贴壁后去除原培养液，用PBS漂洗2遍，4%多聚甲醛固定细胞30 min，后用PBS漂洗5 min×3次，1%甲苯胺蓝染色10 min，0.5%番红O染液滴染1 min，双蒸水洗涤1 min，镜下观察细胞。

1.2.3椎间盘退变大鼠髓核细胞模型建立及给药 将第3代髓核细胞接种于6孔培养板中，将细胞随机分为5组，Ctrl组(空白对照组)、IL-1β组(10 ng/ml)、IL-1β+Taurine组(100 μg/ml)、IL-1β+Taurine组(200 μg/ml)和IL-1β+Taurine组(400 μg/ml)，将各组细胞培养24 h 后进行后续实验。

1.2.4Hochest33342染色检测髓核细胞凋亡率 将上述各组细胞用PBS漂洗2遍，4%多聚甲醛固定细胞30 min，去除固定液，PBS漂洗3次，加入Hochest33342 1 ml染色15 min，去除染色液，PBS漂洗3次，镜下观察、拍照。

1.2.5蛋白印迹检测Caspase-3、Caspase-9的表达 将1.2.3所述细胞用RIPA蛋白裂解液于冰上提取总蛋白，用BCA试剂盒检测各组蛋白浓度并调平。每组取等量蛋白质用12%SDS-PAGE分离蛋白后，转移蛋白质到PVDF膜。室温封闭蛋白质 2 h，以1∶1 000的浓度加入Caspase-3、Caspase-9一抗，4℃孵育过夜。第二天弃去一抗，用缓冲液清洗PVDF膜后，加入二抗，室温封闭1 h后，滴加ECL于暗室曝光显影。以GAPDH为内参。

1.2.6检测细胞氧化应激因子SOD、 MDA、GSH和LDH的含量 按照说明书操作，检测1.2.3所述各组髓核细胞内氧化应激因子SOD、 MDA、GSH和LDH的含量。

1.2.7ELISA检测细胞炎症因子IL-6、iNOS、IL-10的表达 按照说明书操作，检测1.2.3所述各组髓核细胞内炎症因子IL-6、iNOS、IL-10的表达水平。

1.2.8Western blot检测NF-κB p65的磷酸化和TNF-α的表达水平 用1.2.4所述方法检测NF-κB p65、p-p65(即p-p65/p65相对表示水平)、TNF-α的表达，以评价NF-κB p65的磷酸化水平和TNF-α的表达水平。

1.2.9免疫荧光检测p65的入核情况 将1.2.3所述细胞培养24 h后，用PBS漂洗细胞2遍，4%多聚甲醛固定细胞15 min，去除固定液，PBS漂洗3次，加入1 ml DAPI染液，室温染色5 min，轻轻吸去染液，PBS漂洗3次，镜下观察。

2 结果

2.1髓核细胞的鉴定 本实验采用Ⅱ型胶原酶分离培养原代髓核细胞，对第2代髓核细胞进行番红和甲苯胺蓝染色对细胞进行鉴定。结果表明：如图1所示，经番红染色可见细胞质和细胞核均被染成棕黄色；而经甲苯胺蓝染色可见细胞质被染成天蓝色，且靠细胞核越近染色越深；当两者染色后均可见细胞呈现三角形或多边形的“铺路石”样，细胞形态符合软骨细胞形态特点，因髓核细胞是特殊类型的软骨细胞，故可说明髓核细胞分离成功。

2.2牛磺酸对IL-1β诱导的髓核细胞凋亡率及Caspase-3、Caspase-9表达的影响 用Hochest33342对各组细胞进行凋亡率检测，结果如图2A、B所示：与Ctrl组相比，IL-1β组细胞核固缩、染色加深明显，细胞凋亡率显著上调(P<0.01)；经牛磺酸处理后，各模型加药组细胞核固缩、染色加深程度降低，细胞凋亡率较IL-1β组均下调(P<0.01)，且这种下调作用随牛磺酸浓度的增加而增强。另外，蛋白印迹实验显示，如图2C所示：与Ctrl组相比，IL-1β组Caspase-3、9的相对蛋白表达水平均显著上调(P<0.01)；而经牛磺酸处理后，随牛磺酸浓度的增大Caspase-3、9的相对蛋白表达水平较Ctrl组均明显下调(P<0.01)。

综上所述，IL-1β能诱导髓核细胞发生凋亡，上调凋亡相关蛋白Caspase-3、-9的表达，而牛磺酸可以负向调节其对髓核细胞凋亡和凋亡相关蛋白Caspase-3、-9表达的上调作用。

2.3牛磺酸对IL-1β诱导的髓核细胞氧化应激因子SOD、 MDA、GSH和LDH含量的影响 检测各组细胞中氧化应激因子的含量，结果如图3所示：与Ctrl组相比，IL-1β组细胞SOD、GSH含量显著降低(P<0.01)，MDA、LDH含量显著升高(P<0.01)；经不同浓度牛磺酸作用后，各模型加药组细胞SOD、GSH含量较IL-1β组呈牛磺酸剂量依赖性的升高，同时MDA、LDH含量随牛磺酸浓度增加而降低(P<0.01)。说明，IL-1β能诱导髓核细胞产生MDA、LDH，降解SOD、GSH，而牛磺酸可以剂量依赖性地减弱IL-1β对上述氧化应激因子的作用。

图1 番红染色和甲苯胺蓝染色鉴定髓核细胞Fig.1 Nucleus pulposus cells were identified by safranin O staining and toluidine blue staining

图2 牛磺酸对IL-1β诱导的髓核细胞凋亡率和凋亡相关因子表达的影响Fig.2 Effects of taurine on apoptosis rate of NP cells induced by IL-1β and expression of apoptosis related factorsNote:A.Apoptosis detected by Hochest33342；B.Statistical analysis of apoptosis rate in NP cells；C.Western blot analysis demonstrating the effect of taurine on the Caspase-3，9 protein expression levels and the statistical analysis of them.**.P<0.01 versus Ctrl group;##.P<0.01 versus IL-1β group.

图3 牛磺酸对髓核细胞氧化应激因子含量的影响Fig.3 Effects of taurine on content of oxidative stress factors in IL-1β-treated nucleus pulposus cellsNote:**.P<0.01 versus Ctrl group;##.P<0.01 versus IL-1β group.

图4 牛磺酸对髓核细胞炎症因子表达水平的影响Fig.4 Effect of taurine on protein level of inflammatory factors in IL-1β-treated nucleus pulposus cellsNote:**.P<0.01 versus Ctrl group;##.P<0.01 versus IL-1β group.

2.4牛磺酸对IL-1β诱导的髓核细胞炎症因子IL-6、iNOS、IL-10表达水平的影响 采用ELISA方法检测各组细胞中炎症因子的表达水平，结果如图4所示：与Ctrl组相比，IL-1β组细胞IL-6、iNOS表达被显著上调(P<0.01)，而IL-10表达呈现明显下调趋势(P<0.01)；当用不同浓度牛磺酸作用后，各模型加药组细胞IL-6、iNOS表达水平较IL-1β组呈牛磺酸剂量依赖性的降低，同时IL-10的表达随牛磺酸浓度增加而明显上调(P<0.01)。说明，IL-1β能诱导髓核细胞分泌炎症因子IL-6、iNOS，同时促进IL-10的降解，而牛磺酸可以剂量依赖性地减弱IL-1β对上述炎症因子的调节作用。

图5 牛磺酸对NF-κB p65磷酸化、TNF-α表达和p65入核的影响Fig.5 Effects of taurine on NF-κB p65 phosphorylation,TNF-α expression and p65 entry in IL-1β-treated nucleus pulposus cellsNote:A.Immunofluorescence method was used to detect the nucleation of p65；B.Statistical analysis of nucleation of p65；C.Western blot analysis demonstrating the effect of taurine on the TNF-α，p-p65 and NF-κB p65 protein expression levels and the statistical analysis of them.**.P<0.01 versus Ctrl group;##.P<0.01 versus IL-1β group.

2.5牛磺酸对IL-1β诱导的髓核细胞NF-κB p65磷酸化、TNF-α表达和p65入核情况的影响 采用免疫荧光法检测p65的入核情况，结果如图5A、B显示：IL-1β组细胞核内荧光量较Ctrl组明显增加(P<0.01)；而与IL-1β组相比，各模型加药组细胞核内荧光量明显减少(P<0.01)，且随着牛磺酸浓度的增加，荧光量逐渐减少。说明，牛磺酸能剂量依赖性减少p65的入核量。

蛋白印迹实验检测各组髓核细胞NF-κB p65磷酸化情况，以及TNF-α表达水平，结果如图5C所示：与Ctrl组相比，IL-1β组p-p65/p65、TNF-α表达水平均显著上调(P<0.01)；同时，各模型加药组p-p65/p65、TNF-α表达水平较IL-1β组均呈显著下降(P<0.01)，且随牛磺酸浓度的增加下降程度也逐渐增强。说明牛磺酸可以负向调节IL-1β诱导的NF-κB p65磷酸化和TNF-α表达水平。

3 讨论

IL-1β是促炎性细胞因子IL-1家族的一员，是参与调节机体免疫应答和炎症反应的关键介质，能加剧慢性疾病和急性组织损伤，包括炎症性肠病、类风湿性关节炎、各种自身免疫和自身炎症疾病，IL-1β表达上调能增加椎间盘软骨终板细胞内相关炎症因子表达，进而加速椎间盘退变进程[12-17]。本实验采用Ⅱ型胶原酶法成功分离大鼠髓核细胞，并用10 ng/ml IL-1β处理髓核细胞以建立椎间盘退化细胞模型。

诱导细胞凋亡是多种疾病得以发生发展的机制之一，研究表明牛磺酸具有抑制NMDA诱导的视网膜细胞凋亡的作用[18]。体内研究也证实，在老化和退变的椎间盘中存在氧化应激和氧化产物浓度的增加，前者通过线粒体途径诱导细胞凋亡，引起髓核细胞活性下降，过早凋亡和衰老，是椎间盘退变的发病机制之一[19，20]。本实验以成功培养的第3代大鼠髓核细胞为研究对象，用不同浓度的牛磺酸处理模型加药组细胞，发现牛磺酸能降低IL-1β诱导的髓核细胞凋亡率。另外，研究表明髓核细胞的凋亡可能与Caspase-3、Bcl-2信号转导有关[21]。本研究发现，牛磺酸抑制了IL-1β对髓核细胞中凋亡执行蛋白Caspase-3、Caspase-9表达的上调，且其抑制作用与牛磺酸浓度呈正比。综合实验结果表明牛磺酸能降低髓核细胞的体外凋亡水平。

正常情况下，活性氧(ROS)的生成和去除应处于动态平衡，当身体处于氧化应激状态时，细胞内分子氧将集聚增加，脂质过氧化水平升高，最终导致DNA损伤和异常蛋白质表达[22]。Rannou等[23]研究表明炎症明显的椎间盘会持续压迫脊髓或神经根，激活iNOS，产生大量NO，从而增加受损区域的iNOS表达水平。Esposito等[24]也证实，通过抑制IL-1β和iNOS的表达，能有效抑制β淀粉样蛋白诱导的神经炎症。而大量研究发现，牛磺酸被认为是一种抗氧化剂，可以抑制肥胖诱导的氧化应激和脂肪细胞的炎症[25，26]，但其抗氧化性能的细胞机制尚未明确。腹腔注射牛磺酸可减轻黏菌素诱导的肾组织氧化应激和线粒体功能障碍[27]。本文研究表明，牛磺酸能降低髓核细胞内IL-1β诱导产生的氧化应激因子，从而减少氧化应激反应，降低对髓核细胞的伤害。

NF-κB信号通路对炎症性疾病起着重要作用，在骨关节炎细胞中，可见NF-κB p65磷酸化水平升高，进而增加下游TNF-α等炎症细胞因子的表达[28]。关于炎症因子在椎间盘中的作用研究，Wang等[29]研究发现，IL-1β、IL-4和肿瘤坏死因子均参与细胞外基质的合成和分解，在椎间盘细胞凋亡中起重要作用。而通过抑制NF-κB的磷酸化激活，能有效抑制TNF-α、IL-1β等炎症细胞因子产生，从而改善炎性损伤[30]。本文研究发现IL-1β能促进NF-κB p65磷酸化、TNF-α表达和p65入核，但是这种促进作用可以被牛磺酸剂量依赖性的弱化，从而减轻炎症反应。

综上所述，本文采用Ⅱ型胶原酶成功分离大鼠髓核细胞，并用10 ng/ml IL-1β诱导建立椎间盘退变细胞模型，以此作为研究对象初步探讨牛磺酸对椎间盘模型大鼠髓核细胞凋亡、炎症和氧化应激的保护作用，结果说明牛磺酸可以通过抑制Caspase-3、-9表达，降低细胞凋亡率，清除氧化产物自由基，抑制炎症因子表达，降低NF-κB p65磷酸化水平，减少TNF-α表达和p65入核，实现对椎间盘退变模型大鼠髓核细胞凋亡、炎症和氧化应激的保护作用。本文的研究旨在为椎间盘退化的治疗提供一个新的方向。