细菌M19降解黄曲霉毒素B1降解产物的毒性分析

王佳兴 谢岩黎 宋 娟

(河南工业大学 粮油食品学院1，郑州 450001) (河南省粮油食品安全检测与控制重点实验室2，郑州 450001)

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试剂及培养基配置

细胞培养液的配制：在90 mL培养基(RPMI 1640培养基)中加入10 mL胎牛血清，必要时加入1%的双抗(青链霉素混合液)，配制成RPMI 1640完全培养基。

2-氨基芴、大鼠肝S9活化系统、二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、RPMI-1640培养基、青链霉素混合液、磷酸盐缓冲液(PBS)、CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒。

1.1.2 实验菌株及细胞

鼠伤寒沙门氏菌TA98，TA100：中国典型培养物保藏中心。

人肝癌细胞系HepG2，由中国科学院细胞库提供。

1.2 仪器与设备

BC-J二氧化碳细胞培养箱；LGT-10C真空冷冻干燥机；BM-37XB倒置显微镜； Infinite F50酶标仪；血球计数板。

1.3 实验方法

1.3.1 Ames实验1.3.1.1 实验菌株培养

将两个菌株分别接种于营养肉汤(按GB15193.4—2014配置)中，37 ℃摇床(100 r/min)培养10 h，培养过程中注意用锡纸包裹。

1.3.1.2 自发回变数的测定

向2 mL顶层培养基(融化状态)中加入菌液0.1 mL，迅速摇匀倒入底层培养基平板中，转动平板使平板表面平整均匀，37 ℃培养48 h，计数每个平板的菌落总数。

1.3.1.3 AFB1降解后的致突变性(Ames)实验

1)受试物的准备

将25μL AFB1标准溶液(浓度为100 μg/mL)与975 μL PADE在37 ℃，180 r/min暗处降解72 h，分别在降解0、1、2、3 d的时间点向反应体系中加入3 mL的二氯甲烷涡旋进行萃取，获得降解后的有机相受试物(二氯甲烷层)和水相受试物，有机相在氮气下吹干重新溶解在DMSO，使原AFB1的浓度分别为2.5、0.5、0.1 μg/mL；水相进行冷冻干燥，重新溶解在DMSO中，与有机相设置相同浓度稀释。将DMSO作为溶剂对照，0.1 mg/mL的氨基芴作为阳性对照，所有待检测溶液都要过滤除菌。

2)平板掺入法测定AFB1降解后的致突变性

与自发回变数的操作相同，只是加入菌液的同时加入0.1 mL的受试物溶液(将0.1 mL菌液与0.1 mL受试物溶液提前混合或者先向顶层培养基中加入受试物45 ℃水浴，再加入菌液)，代谢活化组还需要加入0.5 mL大鼠肝S9活化溶液。

1.3.2 CCK-8法检测细胞增殖-毒性

AFB1的准备：分别配置1.0、2.5、5.0、10.0μg/mL的AFB1溶液，在氮气下吹干，用DMSO溶解，再添加RPMI-1640完全培养液，使DMSO的含量为1%。

降解后产物的准备：降解反应结束后(72 h)，通过二氯甲烷萃取分别获得有机相和水相，有机相通过氮气吹干二氯甲烷，残留物用DMSO(1%)溶解，再用RPMI-1640完全培养液稀释，使原AFB1浓度分别为1.0、2.5、5.0、10.0 μg/mL；水相通过冷冻干燥去除水分，重新溶解在DMSO(1%)中，加入RPMI-1640完全培养液，配置相应浓度的待测物质。

将制备的细胞悬液以及不含细胞的完全培养液(100 μL/孔)加入96孔板，在培养箱培养过夜(待细胞贴壁生长状态良好)，再将孔板取出加入10 μL不同浓度的待测物质，继续培养24 h，再向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，在培养箱中孵育1～4 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。设置空白孔(无细胞的培养液，不加药)，对照孔(含细胞的培养液，1%DMSO的培养液)，实验孔(含细胞的培养液，不同浓度的待测物质)。细胞存活率的计算：

2 结果与分析

2. 1 Ames实验结果

2.1.1 实验菌株生物学鉴定标准

对于生物学特性鉴定合格及自发回变菌落数在正常范围内(表1)的测试菌株可进行样品测试。平板掺入法的结果评价标准为[20-22]，测试菌株TA98的回变菌落数等于或大于无处理对照组的2倍，其他测试菌株的回变菌落数等于或大于无处理对照组的2倍，并具有以下两种情况之一的可判定为阳性结果：1)有剂量-反应关系；2)某一测试点有可重复的阳性结果。

表1 实验菌株生物学鉴定标准

注：+表示阳性，-表示阴性。

2.1.2 自发回变数的测定

由表2可知，这两株菌的自发回变菌落数均在正常范围内。

表2 测试菌株的自发回变数

2.1.3 AFB1降解后的致突变性分析

在未有代谢活化物激活受试物的情况下(图1)，未降解组(降解0 d)，有机相受试物测试，在2.5 μg/mL浓度时，TA98和TA100的回变菌落数较大(大于阳性对照组)，且在0.1 μg/mL浓度下，TA98的回变菌落数与浓度呈比例关系；在降解1 d的情况下，有机相受试物测试，三个浓度下TA98和TA100的回变菌落数超过溶剂对照的2倍，但浓度与回变菌落数之间不存在比例关系，且与未降解组相比回变数明显减少；在降解2 d的情况下，有机相受试物测试，三个浓度下TA98和TA100的回变菌落数明显减少(与降解0 d和降解1 d的相比)，浓度与回变菌落数之间无比例关系，TA98的回变菌落数远超过溶剂对照组的两倍，TA100的回变菌落数达到溶剂对照组的一倍多；在降解3 d的情况下，有机相受试物测试，TA98和TA100在三个浓度下的回变菌落数与溶剂对照组及自发回变相比，无很大差别。水相受试物测试中，整个过程三个浓度下TA98和TA100的回变菌落数与溶剂对照的无明显差别。

注：a、b分别为TA98和TA100在AFB1剂量分别在0.1、0.5、2.5 μg/mL情况下有机相受试物的致突变性；c、d分别为TA98和TA100在AFB1剂量分别在0.1、0.5、2.5 μg/mL情况下水相受试物的致突变性。图1 待测物致突变性检测结果(S9-)

结果显示，在降解0 d 时，有机相受试物为致突变阳性，且致突变性极强(较强的致癌性)，在降解1 d到降解2 d时，AFB1已经降解一部分，总的来看还是呈现致突变阳性，在降解3 d时，呈现致突变阴性；在该实验条件下水相受试物对TA98和TA100无致突变作用。

在代谢活化物(S9)活化情况下(图2)，所有测试组的回变菌落数与未代谢活化的相比普遍增多。未降解组(降解0 d)，有机相受试物测试，TA98的回变菌落数在浓度0.1 μg/mL时呈相应的比例关系，TA100的回变菌落数大于阳性对照组并远远大于溶剂对照组；随着降解时间的延长，三个浓度下TA98和TA100的回变菌落数均呈下降趋势。在降解3 d的情况下，有机相呈现致突变阴性。水相受试物测试中，整个过程三个浓度下TA98和TA100的回变菌落数与溶剂对照的无明显差别。

结果显示，在降解0 d时，有机相受试物(AFB1)表现出强致突变作用；在降解1 d到降解2 d时，降解的量还很少，有机相受试物中还存在较多的AFB1，仍是表现出致突变阳性；在降解3 d的情况下，有机相呈现致突变阴性。在该实验条件下水相受试物对TA98和TA100均无致突变作用。

结果表明，AFB1经过降解后，其致突变性明显降低，降解3 d后，其降解产物已表现出致突变阴性结果。李文明[23]研究AFB1降解产物的致突变性，将反应体系经旋蒸干燥重新溶解，通过Ames实验的平板掺入法检测降解产物的致突变性，得到降解产物是低毒或无毒的结果，与本研究结果相似。Alberts等[24]和Rao等[25]均将有机相和水相进行了Ames实验检测，得到了相似的结论。

注：a、b分别为TA98和TA100在AFB1剂量分别在0.1、0.5、2.5 μg/mL情况下有机相受试物的致突变性；c、d分别为TA98和TA100在AFB1剂量分别在0.1、0.5、2.5 μg/mL情况下水相受试物的致突变性。图2 待测物致突变性检测结果(S9+)

2.2 细胞毒性实验

2.2.1 AFB1处理HepG2细胞后的细胞存活率

HepG2细胞在1.0、2.5、5.0、10.0 μg/mL的AFB1标准溶液作用24 h后，利用cck-8法检测细胞存活率。结果显示，以未经任何处理的细胞作为对照，AFB1作用24 h后的细胞活性随着 AFB1浓度的增加而呈下降趋势，2.5 μg/mL时细胞活性已低于72%，10.0 μg/mL时细胞活性已低于56%。

2.2.2 AFB1降解后的细胞毒性

在所测浓度范围内，降解后产物对HepG2细胞的抑制率均小于17%，降解后有机相的细胞毒性随着AFB1的浓度增加略有提高但无明显差异，初始浓度为2.5 μg/mL的AFB1经降解后，有机相降解液作用于细胞的存活率达到92%；初始浓度为10.0μg/mL的AFB1经降解后，有机相降解液作用于细胞的存活率达到83%，降解后水相对HepG2的细胞存活率均在91%以上。数据分析，降解后的细胞毒性与降解前相比明显降低，只有微量毒性，这与Liu等[26]研究结果相似。

2.2.3 不同浓度的AFB1及其降解物对HepG2细胞的影响

对照组(未处理)细胞呈多边形密度大。经过AFB1处理的细胞，数量明显减少，部分细胞形态发生显著改变，细胞褶皱，有些细胞死亡而不再紧密贴壁，有些细胞呈圆形，还有些细胞呈现半透明状态推测其即将凋亡(图3)。

图3 不同浓度AFB1处理下的HepG2细胞状态

不同浓度AFB1降解后作用于HepG2细胞后，细胞其数量稍有减少(倒置显微镜下观察)。图4为有机相降解液对HepG2细胞生长状态的影响，整体上细胞浓度有所减少，有些细胞边界不清晰，折光性差。图5为水相降解液对HepG2细胞生长状态的影响，整体细胞状态比有机相降解液处理的细胞状态稍好，细胞形态稍有改变，折光性稍差。在5.0 μg/mL的浓度下，细胞有些稀少；在10.0 μg/mL的浓度下，细胞密度大，可见对细胞的毒害较小，这与前人的研究结果相似[27]。

图4 不同浓度有机相降解液对HepG2细胞形态的影响

图5 不同浓度水相降解液对HepG2细胞形态的影响

3 结论

本研究对AFB1经PADE降解后的产物进行毒性分析，将降解后的产物分为有机相和水相，分别对有机相和水相进行Ames实验和细胞毒性实验分析。

1)Ames实验结果表明，AFB1经PADE降解后对鼠伤寒沙门氏菌TA98、TA100的致突变作用显著小于空白对照组(未降解的AFB1)，甚至与自发突变无显著差异，降解3 d后，其降解产物已表现出致突变阴性结果。

2)细胞毒性实验表明，与未处理细胞组相比，经AFB1降解产物作用的细胞存活率均达到83%以上。AFB1经PADE降解后其细胞毒性明显降低(与AFB1相比)，在低浓度AFB1经过降解的情况下，降解后无细胞毒性。