投饲频率对青鱼生长、生理生化指标及摄食相关基因表达水平的影响

2020-05-25潘伟平王伊凡应李民简杰亮杨继成叶金云明建华

中国粮油学报 2020年4期

潘伟平王伊凡应李民简杰亮杨继成叶金云明建华

(湖州师范学院，湖州 313000)

在集约化和规模化的水产养殖中，主要通过投喂人工配合饲料来养殖水产动物，其中饲料投饲频率是影响鱼类生长及饲料效率的重要因素之一[1]。有关鱼类投喂频率的研究表明，适宜的投喂频率可以增加鱼类的生长速度和存活率，缩小体型差异，改善摄食转换率，提高终产量；而不合理的投喂频率不仅导致鱼体参差不齐，还会造成饲料浪费，增加养殖成本，并污染养殖环境[2-4]。因此，确定适宜的投饲频率对提高青鱼养殖的经济和生态效益具有重要意义。

目前，有关黄颡鱼(Pelteobaggrusvachelli)幼鱼[5]、星斑川鲽(Platichthysstellatus)幼鱼[6]等鱼类的研究表明，适宜的投饲频率可改善幼鱼的摄食量并增加生长速度；而对鲤鱼(Cyprinuscarpio)、长吻鮠(Leiocassislongirostris)的研究表明，适宜的投饲频率可降低循环养殖系统水体氨氮类有毒有害物质的含量，改善水质，提高鱼类的存活率[7]。青鱼(MylopharyngodonpiceusRichardson)是我国传统淡水养殖的“四大家鱼”之一，据《2019中国渔业统计年鉴》报道[8]，我国青鱼养殖年产量为69.13万t，而目前有关投饲频率对青鱼相关影响的研究仍鲜见报道。因此，本试验以青鱼为研究对象，探讨不同投饲频率对青鱼幼鱼生长、生理生化指标以及摄食相关基因表达水平的影响，以便获得青鱼幼鱼生长速度最快和饲料转化率最佳的投饲频率，为青鱼的集约化养殖提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验青鱼及放养

青鱼幼鱼购于湖州市吴兴丰溢现代水产养殖场。试验选择450尾体质健壮，规格基本一致的青鱼幼鱼，初始体质量(12.29±0.40)g，随机分成5组，每组设3个重复，每个重复30尾鱼，饲养于本实验室室内循环水养殖系统的15个养殖桶中。每桶水容积450 L，控制水流速为1.6 L/min，并通过气石持续充气增氧。

1.2 饲料制备与投喂

试验饲料组成及营养水平见表1，各种原料分别粉碎过60目筛，采用逐级扩大法添加微量成分，使各组分充分混匀后，用小型饲料造粒机制成粒径2 mm的沉性颗粒饲料，40 ℃烘干后于4 ℃冰柜中保存备用。

表1 试验饲料组成及营养水平(风干基础)

注：a表示购于企业；b为实测值。

饲养试验中，前期驯化7 d，后期正式饲养60 d。采用人工投饲，日投饲量按鱼体质量的2～5%来计算，并控制在30 min内无剩饵为宜，即表观饱食。投饲频率如下：(1)投喂1次/2 d，投喂时间为8:00；(2)投喂1次/d，投喂时间为8:00；(3)投喂2次/d，投喂时间为8:00、17:00；(4)投喂3次/d，投喂时间为8:00、12:30、17:00；(5)投喂4次/d，投喂时间为8:00、11:00、14:00、17:00。饲养期间水温为26～29 ℃，pH为7.2～7.8，溶解氧>6 mg/L，氨氮<0.01 mg/L。

1.3 采样与处理

正式饲养60 d后采样，采样前禁食24 h，将各桶鱼称重、计数，然后每桶随机选取3尾体重相近的青鱼，用浓度为100 mg/L的MS-222作快速深度麻醉，经称重和量体长后用一次性医用注射器从尾静脉采血。血样在4 ℃冰箱中静置1～2 h后，以4 ℃ 3 000 r/min离心10 min制备血清，-20 ℃冻存备用。

鱼体采血后立即剖开腹腔，剥离出内脏和肝胰脏并称重，取适量肝脏和肠道用于常规分析；取部分背鳍下方侧线以上的背部肌肉用于肌肉成分分析；取适量脑组织，用于摄食相关基因的表达分析，均以-80 ℃保存。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 生长与形体指标

分别按下式计算增重率(WG)、特定生长率(SGR)、摄食率(FR)、饲料系数(FCR)、存活率(S)、肝体指数(HSI)、脏体指数(VSI)、肥满度(CF)：

增重率(WG，%) = 100× (Wt-W0) /W0

特定生长率(SGR，%/d) = 100×(lnWt- lnW0) / t

摄食率(FR，%/d) = 100×FI/ [t×(Wt+W0)/2]

饲料系数(FCR) =FI/ (Wt-W0)

存活率(S，%) = 100 ×Nt/N0

肝体指数(HIS，%) = 100×Wh/Wb

脏体指数(VSI，%) = 100×Wv/Wb

式中：W0为鱼初体质量/g；Wt为鱼末体质量/g；t为饲喂天数/ d；FI每尾鱼平均摄食饲料总质量(风干样重)/g；N0为初鱼尾数；Nt末鱼尾数；Wh为每尾鱼末肝脏质量/g；Wv为每尾鱼末内脏质量/g；Wb为每尾鱼末体质量/g；L为每尾鱼末体长/cm。

1.4.2 肌肉成分分析

水分采用105 ℃恒重法(GB 6435—1986)测定；粗蛋白质含量采用微量凯氏定氮法(GB/T 6432—1994)测定；粗脂肪含量采用索氏抽提法(GB/T 6433—1994)测定；粗灰分含量采用550 ℃灼烧法(GB/T 6438—1992)测定。

1.4.3 血清生化指标的测定

超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LSZ)、碱性磷酸酶(AKP)、谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)的活性等用南京建成生物工程研究所试剂盒，按照说明书进行测定。

1.4.4 肝脏抗氧化相关指标的测定

肝脏样品解冻后，用冷生理盐水冲洗干净并用滤纸吸干后称重，肝脏样品与匀浆介质(pH 7.4，0.01 mol/L Tris-HCl，0.000 1 mol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L蔗糖，0.8%氯化钠溶液)按1∶9 (W∶V)的比例冰浴匀浆，然后4 ℃ 3 800 r/min离心10 min，取上清液用于分析。该待测液的蛋白质浓度采用考马斯亮蓝法进行测定。SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)的水平等按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行测定。

1.4.5 肠道消化酶活性的测定

试验采用田间小区法。2016年设上年秋季（10月中旬）覆膜、当年早春（4月初）覆膜两个非生育期覆膜处理和常规播前（4月下旬）覆膜为对照。小区面积242 m2，小区宽11 m，小区长22 m，3次重复，随机排列。专用机械覆膜，采用170 cm宽的黑色地膜。

测定前将肠组织样品取出，在室温下自然解冻，剔除脂肪和消化道内含物。取全肠称重，然后加入9倍冷却的磷酸缓冲液(4 ℃，pH7.3)，冰浴匀浆(8 000 r/min，5 s/次，间隔10 s，连续4～5次)，取上清液置于4 ℃冰箱中待测(不超过24 h)。检测肠道胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性的试剂盒购于南京建成生物工程研究所，按照说明书进行测定。

1.4.6 脑组织摄食相关基因的表达分析

使用组织/细胞RNA快速提取试剂盒(Aidlab，中国)抽提青鱼脑组织总RNA，具体操作按试剂盒说明书进行，然后用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA的完整性，同时用NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific，美国)核酸蛋白测定仪检测RNA的纯度和浓度，RNA样品应具有清晰完整的条带、OD260/OD280为1.8～2.0。用PrimeScriptTM反转录试剂盒(TaKaRa，日本)将总RNA反转录合成cDNA，并于-20 ℃保存备用。

根据GenBank上青鱼脑组织摄食相关基因神经肽Y(Neuropeptide Y, NPY)和脑肠肽(Ghrelin, GRL)的核苷酸序列，利用Primer 5.0设计上述基因及管家基因β-肌动蛋白(β-actin)的特异性引物，引物序列见表2。所有引物均由上海英潍捷基(Invitrogen)公司合成。

1.5 数据处理与分析

实验数据用SPSS 16.0统计软件包中的单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏多重比较，P<0.05表示差异显著。实验结果以平均值±标准差(Means±SD)表示。

表2 实时定量PCR引物

2 结果与分析

2.1 投饲频率对青鱼生长性能的影响

由表3可知，投饲3次/d的青鱼幼鱼增重率、特定生长率和摄食率显著高于1、2次/d和1次/2d组(P<0.05)，而投饲3、4次/d之间的差异不显著(P>0.05)；投饲4次/d的饲料系数显著高于1次/2 d和1次/d(P<0.05)，而与其余各组之间的差异不显著(P>0.05)；投饲3、4次/d组的青鱼存活率显著高于1次/2d组(P<0.05)，而其余各组间的差异不显著(P>0.05)；投饲频率对青鱼幼鱼的肝体指数、脏体指数与肥满度无显著影响(P>0.05)。由此可见，青鱼幼鱼每天投喂3次可显著提高其增重率、特定生长率、摄食率和存活率，促进青鱼幼鱼的生长。

表3 投饲频率对青鱼生长及形体指标的影响

注：3个重复的平均值±标准差(SD)；9个样本的平均值±SD；同行数据中有不同上标字母者表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

表4 投饲频率对青鱼肌肉成分的影响/%

注：表中值为9个样本的平均值±SD；同一行数据中有不同上标字母者表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)，下同。

表5 投饲频率对青鱼血清生化指标的影响

表6 投饲频率对青鱼肝脏抗氧化相关指标的影响

2.2 投饲频率对青鱼肌肉成分的影响

由表4可知，青鱼幼鱼肌肉粗脂肪的含量随投饲频率的增加而升高，与投饲1次/2 d相比，投饲4次/d可显著提高青鱼肌肉中粗脂肪的水平(P<0.05)，但投饲频率对青鱼幼鱼肌肉的水分、粗蛋白和灰分无显著影响(P>0.05)。

2.3 投饲频率对青鱼血清生化指标的影响

由表5可知，随着投饲频率的增加，血清中超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LSZ)和碱性磷酸酶(AKP)的活性呈升高的变化趋势，而谷丙转氨酶(GPT)呈下降的变化趋势(P<0.05)，但对谷草转氨酶(GOT)的活性无显著影响(P>0.05)。投饲3次/d的超氧化物歧化酶活性显著高于1、2次/d与1次/2 d组(P<0.05)，而3次/d与4次/d之间的差异不显著(P>0.05)；投饲3、4次/d的溶菌酶活性显著高于1次/2 d组的水平(P<0.05)，而与其他各组间的差异不显著(P>0.05)；投饲2～4次/d的碱性磷酸酶活性显著高于1次/d、1次/2 d组(P<0.05)，而投饲2～ 4次/d组之间的差异不显著(P>0.05)；投饲1次/2 d的GPT活性显著高于2～4次/d组(P<0.05)，而投饲2～4次/d组之间的差异不显著(P>0.05)。结果表明，青鱼幼鱼每天投饲3次，可增强其非特异性免疫力。

2.4 投饲频率对青鱼肝脏抗氧化相关指标的影响

由表6可知，随着投饲频率的增加，青鱼肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性呈上升的变化趋势，而丙二醛含量呈现下降的变化趋势。投饲3、4次/d的SOD活性显著高于1次/2 d组(P<0.05)；投饲3次/d的谷胱甘肽过氧化物酶活性显著高于1次/d和1次/2 d的水平(P<0.05)；投饲2～ 4次/d组的过氧化氢酶的活性显著高于1次/d和1次/2 d的水平(P<0.05)；投饲3、4次/d组的丙二醛含量显著低于1次/d和1次/2 d的含量(P<0.05)。这表明青鱼幼鱼每天投饲3次，可增强其抗氧化能力。

2.5 投饲频率对青鱼肠道消化酶活性的影响

由表7可知，随着投饲频率的增加，肠道胰蛋白酶和脂肪酶的活性均呈下降的变化趋势，而淀粉酶的活性呈升高的变化趋势。投饲1次/2 d与1次/d组中胰蛋白酶活性显著高于2～4次/d组的活性(P<0.05)；投饲1次/2 d组中脂肪酶活性显著高于4次/d组(P<0.05)，而与其余各组间的差异不显著(P>0.05)。投饲2～4次/d组中淀粉酶的活性显著高于1次/d和1次/2 d组的水平(P<0.05)。由此可见，投饲3、4次/d可降低肠道胰蛋白酶和脂肪酶的活性，而增加淀粉酶的活性。

表7 投饲频率对青鱼肠道消化酶活性的影响

2.6 投饲频率对青鱼摄食相关基因表达的影响

由图1可知，随着投饲频率的增加，青鱼脑神经肽Y(NPY)mRNA表达水平呈升高的变化趋势。投饲3、4次/d组的NPY相对表达水平显著高于投饲1次/2 d和1次/d组的水平(P<0.05)，而二者之间的表达水平无显著差异(P>0.05)。

注：柱上不同字母表示同一基因在不同投饲频率下表达水平的差异显著(P< 0.05)，下同。图1 投饲频率对青鱼脑神经肽Y mRNA表达水平的影响

由图2可知，随着投饲频率的增加，青鱼脑肠肽(GRL)表达水平呈升高的变化趋势。投饲3、4次/d组脑肠肽的表达水平显著高于投饲1次/2 d、1次/d组的水平(P<0.05)，但这两组之间无显著差异(P>0.05)。

图2 投饲频率对青鱼脑肠肽mRNA表达水平的影响

3 讨论

3.1 投饲频率对青鱼生长的影响

研究表明，在适宜范围内，增加投饲频率可显著影响养殖鱼类的增重率、存活率和饲料利用效率[2-4]。在本试验中，投饲频率为3、4次/d时，青鱼幼鱼的增重率、特定生长率、摄食率和存活率均显著提高，但饲料系数也显著提高。这与投喂频率对大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)生长性能的影响的是一致的[10]。以前也有相关的研究报道，杂交鲂幼鱼投饲频率从0.5次/d增加至3次/d时的相应增重率显著提高[11]，但饲料系数显著下降，这与本研究不一致；南方鲇(Silurusmeridionalis)特定生长率也随投饲频率的增加而显著提高，但饲料转化率不受投饲频率的影响[12]；楼宝等[13]发现，投饲频率影响黑鲷的生长是由饲料转化率的改变引起的，适宜投饲频率随着黑鲷鱼体重的增加而提高，黑鲷鱼种的适宜饲喂频率为2次/d，黑鲷成鱼的适宜饲喂频率为4次/d。本试验中，随着投饲频率的增加提高了摄食率，促进了青鱼幼鱼的生长，但饲料系数也显著升高，由此可见，投饲频率对青鱼幼鱼生长的影响并非是因为提高了饲料转化率，而摄食率的提高可能才是投饲频率影响青鱼生长的主要因素[12]。

在本试验中，投饲频率对青鱼幼鱼的肝体指数、脏体指数和肥满度等形体指标均没有显著影响。崔超等[14]报道，不同投饲频率对俄罗斯鲟(Acipensergueldenstaedtii)幼鱼的肝体指数和脏体指数没有显著影响，但投饲3、4次/d的肥满度显著高于投饲2、6次/d的水平；但纪文秀[15]研究表明，投饲频率对点带石斑鱼(Epinephelusmalabaricus)的肥满度没有显著影响。

在本研究中，随着投饲频率增加，青鱼的增重率与饲料系数均有所提高，但4次/d组相对3次/d组的增重率不显著，但饲料系数反而增加，此时其摄食量较高而饲料转化效率较低，造成饲料的浪费。这说明在一定范围内，增加投饲频率有助于青鱼的生长，但过高的投饲频率效果反而较差。这与崔超等[14]、纪文秀[15]、林艳[16]等的实验结果一致。

3.2 投饲频率对青鱼肌肉成分、生理生化指标的影响

投饲频率的增加使鱼类摄食率也增加，而过多的营养物质会形成脂肪储积，鱼类体重增加往往伴随着体成分的改变，如脂肪含量增加[17]。在本试验中，与投饲1次/2d相比，投饲4次/d可显著提高青鱼肌肉粗脂肪的水平，而其他成分无显著变化。邱婷婷等[11]对杂交鲂的研究中也发现，青鱼肌肉粗脂肪含量受投饲频率的影响较大，当投饲频率由1次/2 d上升到4次/d时脂肪含量明显增加，反映了鱼体内营养的积蓄量。本实验结果也与在南方鲇[12]、鲈鱼[18](Lateolabraxjaponicus)、大黄鱼[19](Pseudosciaenacrocea)中的报道类似。而在星斑川鲽[6]的研究中，随着投饲频率增加，肌肉中粗蛋白和粗脂肪的含量均有所提高，可能与星斑川鲽饥饿时主要利用脂肪而青鱼还可适当利用糖类有关[20]，吸收利用的饲料糖类可部分以体脂的形式储存于鱼体内[17]。

超氧化物歧化酶(SOD)和碱性磷酸酶(AKP)是鱼类非特异性免疫的重要因子，在机体免疫防御中发挥重要作用[21]。溶菌酶是生物体内重要的非特异性免疫因子之一，它产生于嗜中性粒细胞和巨噬细胞，并被分泌到血液及粘液中发挥溶菌效应，研究表明机体溶菌酶活性提高，其免疫力也相应提高[22]。本试验中，投饲3、4次/d显著提高了青鱼血清SOD、AKP以及溶菌酶的活性。林艳等[16]研究表明，投饲3、5次/d也可提高团头鲂(Megalobramaamblycephala)血浆碱性磷酸酶活性。Li等[23]报道，投饲3次/d可显著提高团头鲂攻毒后血浆溶菌酶的活性。

动物机体在新陈代谢的过程中，活性氧自由基(ROS)的产生和消除保持着动态平衡，过多的自由基会引起脂质过氧化反应，丙二醛(MDA)是脂质过氧化物的主要成分，具有很强的生物毒性，会破坏细胞的结构和功能[24]。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和过氧化氢酶(CAT)等组成的抗氧化酶系统可清除过多的自由基，减少脂质的过氧化损伤[25]。本研究中，投饲3、4次/d可显著提高青鱼幼鱼肝脏SOD、GPx和CAT的活性，增强鱼体的抗氧化能力。以前也有类似的报道，投饲5、6次/d可显著提高团头鲂肝脏GPx和CAT的活性，降低肝脏MDA的水平[23]；投饲6次/d也可显著提高日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)肝胰腺SOD、GPx和CAT的活性[26]。

3.3 投饲频率对青鱼肠道消化酶活性的影响

不同动物的生态习性和摄食对象不同，其相应的消化酶的性质也会有所变化[27]。青鱼为肉食性无胃鱼类，主要消化部位中肠道蛋白酶的活性相对较高，青鱼通过改变消化道内各种酶的活性，达到积极利用营养物质[28]。研究表明，提高投饲频率(8次/d)可改善大黄鱼幼体肠道消化酶的活性[19]；投饲频率对瓦氏黄颡鱼肝胰腺中的蛋白酶活性无显著影响，而肠中蛋白酶活性则随投饲频率增加而显著降低[5]；投饲频率对俄罗斯鲟幼鱼肝脏中胰蛋白酶的活性无显著影响，但其淀粉酶和脂肪酶活性随投饲频率的增加而升高[14]。在本实验中，随着投饲频率的增加，青鱼肠道胰蛋白酶和脂肪酶活性呈下降的变化趋势，而淀粉酶活性呈升高的变化趋势。这可能在于减少投饲次数，导致适当的饥饿，有利于促进青鱼对饲料营养成分的消化吸收[5]。

3.4 投饲频率对青鱼脑摄食相关基因表达的影响

神经肽(NPY)和脑肠肽(GRL)是重要的摄食调节因子，均可促进动物的摄食，并调控生长激素的分泌，促进生长。马冠奎[29]研究发现，向斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)腹部注射NPY可以促进鱼体自身NPY及生长激素mRNA的表达。De等[30]向金鱼体内注射微量NPY，也可有效促进金鱼的摄食行为。倪静[31]对中华倒刺鲃(Barbodessinensis)的研究亦发现，促摄食物质的强度与脑NPY的表达量呈正比。NPY能提高脂肪组织中脂蛋白脂肪酶和乙酰辅酶A羧化酶的活性，促进脂肪生成，引起体重增加，还能抑制动物褐色脂肪中交感神经的兴奋性，从而使产热和耗能都减少。GRL是一种具有食欲促进作用的消化道分泌激素，广泛参与生物体内多种生理功能，包括促进摄食、生长激素的释放等[32]。在本研究中，随着投饲频率的增加，青鱼幼鱼脑中NPY和GRL的表达水平均呈升高的变化趋势，投饲3、4次/d的青鱼脑NPY和GRL的表达水平较高，有助于促进青鱼的生长。