基于基因拷贝数的缺失型α地中海贫血检测体系研究

吕姗 王太重 覃茜 李佳 陈发钦

1右江民族医学院附属医院妇产科（广西百色533000）；2右江民族医学院医学检验学院（广西百色533000）；3百色市妇幼保健院遗传实验室（广西百色533000）；4右江民族医学院（广西百色533000）

地中海贫血（简称地贫）已成为世界上影响人群最大的单基因遗传病［1］。在地中海地区、中东及东南亚多见，而在我国，主要分布在广东和广西地区［2］。最新的调查显示，广西地贫的基因携带率为21%（α地贫15.2%，β地贫5.8%）［3］。临床上α地贫的严重程度与α基因缺陷的数量有关［4］。重型地贫目前尚无有效治疗方法，产前筛查和地贫基因检测是优生优育的有效措施［5⁃6］。虽然自2010年开始，广西壮族自治区人民政府启动实施了《广西壮族自治地中海贫血防治计划》，大规模推广地贫的产前诊断，广西中、重型地贫患儿的出生率开始明显下降，但据不完全统计，当前中、重型地贫患者至少有90 000 多例，合计发病率仍高达0.2%。曾庆青［3］研究发现，在调查的300 多例重型地贫患儿中，多于30%是2010年后出生的，说明当前实行的地贫筛查方案存在不足，不利于优生优育。跨越断裂点PCR（Gap⁃PCR）和实时荧光定量PCR（real time PCR）技术是缺失型α地贫常用的筛查技术，但Gap⁃PCR 无法检测未知的基因型。因此，研究设计一个高通量高灵敏度的、能检测非常见基因型的方法，有利于广西开展大规模缺失型α地贫基因突变的分子流行病学筛查，以便及早发现携带者，及早采取防控措施，降低广西人群地贫的基因携带率和患病率有重要意义。自1991年开始，研究者连续报道，在广西境内和广西的近邻广东，检测出“罕见的”缺失α地贫基因突变的基因型［7⁃11］。本研究建立基于α珠蛋白基因拷贝数变化的缺失型α地中海贫血基因突变的高通量检测体系——三重TaqMan 实时荧光定量PCR，通过检测α1、α2、ζ 的基因拷贝数的变化，可以发现上述基因的缺失，实现非常见缺失型α地贫基因型和基因频率的探索，可以有效地在产前进行地贫基因缺陷的诊断，促进优生优育的开展。

1 材料与方法

1.1 临床样本收集收集2018年8月至2019年7月，在百色市妇幼保健院和右江民族医学院附属医院进行地贫筛查的外周血标本共169 例，其中69 例为已知α地贫基因型标本，100 例为临床待测标本。所选标本年龄≥18 岁，EDTA 抗凝，4 ℃保存不超过7 d。样本收集时均得到受检者的知情同意，可用于后续进一步实验研究。

1.2 主要仪器与试剂ABI7500 荧光定量PCR 仪（新加坡Thermo Flisher 公司）；TAKARA HS Taq 酶，10 × PCR Buffer 购自大连宝生物公司；25 mmol/L氯化镁购自珠海宝锐生物有限公司；dNTPs 购自深圳菲鹏生物技术有限公司；无核酶水购自Life公司；组织DNA 提取试剂盒购自深圳优圣康生物科技有限公司；缺失型α地中海贫血基因Gap⁃PCR诊断试剂盒购自深圳益生堂公司。

1.3 基因组DNA 提取基因组DNA 提取与纯化使用深圳优圣康生物科技有限公司生产的组织DNA 提取试剂盒，参照试剂说明书进行。

1.4 引物及探针设计引物及探针的设计参照ZHOU 等［12］的方法，NCBI 下载相关序列后，使用ABI 的Primer Express 软件辅助设计。引物探针的核酸序列见表1。HBA、CRE、HBZ 探针的5'端分别标记有荧光报告基团FAM、JOE、CY5；HBA、CRE 的3'端均标记有荧光淬灭基团BHQ1，HBZ 的3'端标记有荧光淬灭基团BHQ3。符合多重Taq⁃Man 荧光定量PCR 体系要求［13］。引物和探针均由深圳优圣康生物科技有限公司合成。

表1 设计的引物探针核酸序列Tab.1 The designed primers probe nucleic acid sequence

1.5 三重TaqMan 荧光PCR 体系优化参考LIVAK 等［14］和ZHOU 等［12］报道的方法，建立三重TaqMan 荧光PCR 体系并对体系中的缓冲液、引物、探针、镁离子、dNTPs 等成分的浓度进行优化。此体系含主反应液16.5 μL、引物探针Mix 3 μL、Takara DNA 聚合酶0.5 μL、DNA 模板5 μL，反应体系总体积25 μL，引物终浓度400 nmol/L，探针终浓度200 nmol/L。反应程序：95 ℃，5 min；45×（95 ℃，10 s；60 ℃，45 s）。

1.6 数据分析及基因缺失判断见图1。α珠蛋白基因簇位于16 号染色体的短臂（16p13.3），基因大小约为26 kb［15］。每条染色体包含3 个有功能的基因：1 个ζ（或称HBZ）、1 个α2（或称HBA2）和1 个α1（或称HBA1）。每对染色体共有2 个ζ基因，4 个α基因。因此，正常人有2 个ζ基因，4 个α基因。而人类基因组中的某些看家基因（house keeping genes，HKGs），如ρ⁃actin、GAPDH、CREBPP，无论在什么情况下都是2 个拷贝。根据缺失型α地贫分子机制中α 珠蛋白基因和看家基因的拷贝数比例差异，以及2⁃△△ct相对定量分析方法的原理［12］，各缺失的基因型与拷贝数有如下数值规律：正常个体HBZ、HKGs 基因都是2 个拷贝，HBA 为4个拷贝。定量检测时，△ct=ct目的基因-ct参比基因，△△ct=△ct检测标本-△ct正常对照，目的基因2⁃△△ct值即为目的基因与参比基因的比例，计算受检标本的2⁃△△ct值，根据2⁃△△ct值直接分析基因的相对拷贝数，判断基因的缺失，实现缺失型α地贫的快速筛查。

图1 HBA1、HBA2、HBZ 在各种已知缺失型α 珠蛋白基因突变时的缺失表现Fig.1 The deletions of HBA1，HBA2 and HBZ in various known deletions of alpha globin gene mutations

1.7 2⁃△△ct值的确立对69 例已知基因型标本的相对拷贝数定量检测，根据不同HBA 基因拷贝数分组，确定不同拷贝数的2⁃△△ct取值范围，采用均数±标准差表示。不同组间差异的比较用方差分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。判定方法见表2。HBA 基因拷贝数的测定：判定值2⁃△△ct＝1，表示样本HBZ 拷贝数正常，偏差小于0.1 有较好的分辨率，即阳性值为0 ～0.89（2 个平行结果均值），阴性值为0.9 ～1.1（2 个平行结果均值）。判定值介于0.85 ～0.9、0.6 ～0.65 及0.35 ～0.4 之间即为灰度区，需重新检测或用Gap⁃PCR + MLPA 检测验证。HBZ 基因拷贝数的测定：判定值2⁃△△ct＝1，表示样本HBZ 拷贝数正常，偏差小于0.2 有较好的分辨率（判定原理如HBA 拷贝数的判定）；判定值均值< 0.5，表示拷贝数低于正常。

表2 69 例样本中不同HBA 基因拷贝数及其判定值2-△△ctTab.2 The copy numbers of different HBA genes and their decision value 2-△△ct in 69 samples ±s

表2 69 例样本中不同HBA 基因拷贝数及其判定值2-△△ctTab.2 The copy numbers of different HBA genes and their decision value 2-△△ct in 69 samples ±s

HBA 基因拷贝数4 3 2 1例数27 15 19 8 2-△△ct均值1±0.1 0.75±0.1 0.5±0.1 0.25±0.1 2-△△ct 0.9 ～1.1 0.65 ～0.85 0.4 ～0.6 0.15 ～0.35

1.8 诊断性能评价用本实验研究建立的方法与地贫临床常规筛查方法进行对比，用Gap⁃PCR +MLPA 技术进行确认。将100 例临床样本按频数资料数据整理为四格表，计算敏感度和特异度。根据表3 的数据，敏感度计算方法为本方法检测及Gap⁃PCR + MLPA 试验检测均阳性的个数/Gap⁃PCR+MLPA 检测的阳性数；特异度计算方法为本方法检测及Gap⁃PCR + MLPA 试验检测均阴性的个数/Gap⁃PCR+MLPA 检测的阴性数。

2 结果

2.1 临床地贫样本的不同基因拷贝数及基因型频率对100 例临床样本，分别用本实验研究建立的方法和地贫临床常规筛查方法进行检测，Gap⁃PCR + MLPA 技术验证。其中，检测出两个2 基因拷贝的样本，用普通临床试剂盒检测结果为正常4拷贝，通过Gap⁃PCR + MLPA 验证后，证明这两个样本是异常泰国型样本，α基因拷贝为2。检测结果见表3。

表3 100 例临床标本检测结果Tab.3 Test results of 100 clinical specimens

2.2 不同统计结果对比结果显示，本研究建立的方法敏感度和特异度均为100%；临床常规检测方法的特异度为100%，敏感度为96%。本研究建立的方法敏感度高于临床常规检测方法，检测准确，并能发现临床常规检测不能发现的非常见地贫基因型，如泰国基因型。

3 讨论

地贫是一种由于珠蛋白肽链合成速率降低导致珠蛋白肽链合成不平衡的血红蛋白病［16⁃18］，临床表现为溶血性贫血症状。孕妇经过遗传咨询和产前诊断后，可为预防重症地贫患儿提供重要理论依据［19］，产前地贫筛查和地贫基因检测是广东和广西地区当前优生优育的重要措施［20］。

本实验建立的检测方法不同于目前临床所用的检测方法，目前临床对于缺失型α地贫的检测所用的试剂盒只能常规检测几种常见类型的α地贫，如-SEA、⁃α4.2和⁃α3.7［21］，不能检出静止型α地贫，也不能检出非常见的α地贫，且操作繁琐。本研究建立起了基于α珠蛋白基因拷贝数变化的高通量高灵敏筛查方法，采用相对定量技术及2⁃△△ct原理，相对定量α地贫基因拷贝数，从而检测α基因缺失或基因叠加，操作简单可行。同时，由于HBA2 和HBA1 具有高度的同源性，作为一个初筛试验，测定HBA2 和HBA1 是不必要的。因此，本研究仅测定HBA2 和HBA1 的共同特征基因片段HBA。HBZ 基因虽然在成人是关闭的，但如果患儿的2 个HBZ 基因都缺失，将在胚胎期死亡，形成流产，从而增加社会医疗成本。以前的筛查方法，都仅检测HBA2 和HBA1，而忽略HBZ，因而没有关于单纯HBZ 缺失的报道。本研究设计的新的三重TaqMan 实时荧光定量PCR 检测体系加入了对HBZ 基因的检测，或许会检出由HBZ 基因缺失所致的非常见缺失型α地贫。

DNA 的提取是本实验的关键步骤，经比较快速提取法（不分离细胞）、红细胞裂解液分离白细胞、细胞裂解液分离白细胞核、细胞分离液分离白细胞四种方法，若不分离白细胞，直接提取DNA，结果对HBA 及HBZ 的扩增影响非常显著，不符合本实验方法标准。因此，本研究最终选择将所取的临床外周血标本先用白细胞分离液分离白细胞作为前处理，以确保得到最高浓度的DNA。同时，实验结果显示，DNA 提取过程中，95 ℃处理1 h 的步骤不可或缺，对结果有较大影响。

本研究基于α珠蛋白基因拷贝数变化建立的α地贫筛查方法，能够检测常见的和非常见的缺失型α地贫基因突变，其检出效率和准确性较高，敏感度和特异度均为100%，临床常规检测方法的敏感度只有96%。经验证，本研究建立的检测体系能够检测临床常规检验方法未检出的非常见型α地贫基因型泰国型（⁃⁃THAI）。

另外中国南方地区有一定比例的HKαα等位基因，血液学表现较轻，临床诊断困难［22］，某些情况下可能导致HKαα等位基因被误诊为⁃α3.7/αα。目前仍待进一步探索，力求为HKαα基因型与⁃α3.7/αα的鉴别诊断提供更多基因诊断咨询，同时探索出更多非常见缺失型α地贫基因型检测手段。