美沙酮对小鼠行为及肠道微生态影响的研究

邓琦蕾，张 敏，李洪柳，韩婷婷，申元英，*

（1.大理大学公共卫生学院，云南大理 671000；2.大理大学基础医学院，云南大理 671000）

盐酸美沙酮（简称美沙酮）为μ阿片受体激动剂，药效与吗啡类似，美沙酮维持治疗（Methadone maintenancetreatment，MMT）是研究和使用得最好的阿片类药物依赖替代治疗之一，在降低犯罪率、减少HIV（艾滋病）等病毒的感染、改善就业和生活质量等方面起到了积极的作用〔1-3〕。至2014年7月我国MMT工作取得了一定的成效，全国有覆盖28个省（区、市）的765家美沙酮门诊，在治人数为192 920人，年保持率为78.3%〔4〕。长期服用美沙酮对其行为和肠道微生态有何影响，本研究采用小鼠模型尽可能控制其他混杂因素对肠道菌群的影响，探讨美沙酮对肠道正常菌群和菌群失调的小鼠行为和肠道微生态影响，为从肠道微生态的视角研究美沙酮提供参考依据。

1 材料与方法

1.1动物、试剂和设备

1.1.1 实验动物 4～6周龄清洁级雄性昆明种小鼠60只，体质量18～22 g，购自中国人民解放军第三军医大学实验动物中心，许可证号：SCXK-（军）2012-0011。

1.1.2 试剂和仪器 美沙酮口服液（1 mg/mL，由大理市疾病预防控制中心提供）；替硝唑氯化钠注射液（贵州天地药业有限公司，A16121304）；0.9%氯化钠注射液（昆明南疆制药有限公司，A160821）；胰酪大豆蛋白琼脂（TSA，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号：HB0177）；马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号：HB0233）；酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YPD，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号：HB5193）；小鼠SIgA酶联免疫分析试剂盒（96T，上海沪峰化工有限公司，批号：201711）；安琪高活性干酵母；酶标仪；恒温培养箱。

1.2方法

1.2.1 实验分组和处理 正常饮食饲养7 d让其适应周围环境和饮食，随机分组法分为4组：第1组为美沙酮组、第2组为美沙酮+抗生素组、第3组为0.9%氯化钠组、第4组为抗生素组。考虑到抗生素和美沙酮可能引起动物死亡，为保证试验结果准确，第1～2组和第4组适量增加动物数量。第1、2组根据人用美沙酮口服液剂量按照体表面积法换算成小鼠剂量0.3 mg/d，美沙酮口服液0.3 mL/d连续灌胃28 d（美沙酮灌胃的剂量逐天递增，第1～2天、第3～4天的剂量分别为0.1、0.2 mg，第5～28天的剂量为0.3 mg），第3、4组用0.9%氯化钠0.3 mL/d连续灌胃28 d；饮水分别为正常饮水和饮水中加抗生素（V水：V抗生素=2：1）。除处理因素外，各组小鼠饲料和其他条件相同，按时记录每组小鼠的饮食和体质量。见表1。

表1 实验动物分组及处理因素

1.2.2 悬尾实验（tail suspension test，TST） 自制黑色悬尾箱，各组随机选择10只具有代表性的小鼠于灌胃第28天，将小鼠尾部后1/3处用胶带固定，悬挂于支架上，头部距离台面15 cm，计时6 min后停止，对小鼠后4 min（3～6 min）的不动时间进行统计〔5-6〕。

1.2.3 旷场实验（open field test） 自制黑色敞箱（内部场地大小为25 cm×25 cm×30 cm，盒底画纵横各3条线，从而形成16个等大的方格），将上述小鼠面朝墙放入4个拐角方格之一，观察3 min内小鼠穿越底面块数，即水平运动得分（3爪以上跨入邻格或者重心落入）和前肢直立次数，即垂直运动得分（前肢离开水平地面1 cm以上的次数），最后再观察大便颗粒数。每只小鼠测试结束后，湿布洗擦场地并用干布擦干〔5，7〕。

1.2.4 肠组织SIgA含量的测定 小鼠连续灌胃28 d，最后一次灌胃后，小鼠禁食不禁水24 h。采用颈椎脱臼法处死，使用无菌手术器械将小鼠腹腔剖开，采集7 cm的十二指肠和回肠段，0.9%氯化钠清洗内容物后，置于加有1 mL 0.9%氯化钠的离心管中，用医用小剪刀充分剪碎使组织粉碎。离心后取上清液，按照应用双抗原夹心法的小鼠SIgA酶联免疫分析试剂盒说明要求进行检测，用酶标仪检测吸光值，进行数据统计分析。

1.2.5 肠道可培养微生物的培养 选用TSA、YPD、PDA三种培养基选择培养小鼠肠道中需氧菌和兼性厌氧菌、酵母菌以及霉菌等可培养微生物。用灭菌棉签棒采集小鼠结肠、直肠内的粪便，准确称取0.1 g至2 mL离心管中，加入PBS（磷酸盐缓冲液）充分混匀后，离心取上清液进行10倍系列稀释，根据预实验TSA选用10-4～10-7稀释度、YPD选用10-2～10-5稀释度、PDA选用10-1～10-3稀释度，分别取50μL于各培养基上，每个稀释度均设2个重复，均匀涂布后放置于恒温培养箱中培养（需氧菌培养条件：35℃，培养24 h；酵母菌和霉菌培养条件：28℃，培养72 h），培养后进行菌落计数。

2 结果与分析

2.1小鼠饮食和体质量变化从开始给药起，记录每组小鼠的食量，经单因素方差分析4组小鼠实验期间平均食量差异无统计学意义；每周测1次体质量，比较各组小鼠体质量的变化，经单因素重复测量方差分析4组小鼠的体质量差异无统计学意义。见表2。

表2 小鼠饮食和体质量变化

2.2肠组织SIgA含量和行为学实验采用方差分析进行4组间的比较，组间两两比较采用SNK检验或Games-Howell检验，4组小鼠肠组织SIgA含量、悬尾试验后4 min静止不动时间以及旷场试验直立次数，差异具有统计学意义（P＜0.05）。肠组织SIgA含量0.9%氯化钠组显著大于其他3组；悬尾试验静止不动时间美沙酮+抗生素组显著小于美沙酮组和抗生素组；旷场试验直立次数美沙酮+抗生素组显著大于美沙酮组和抗生素组（P＜0.05）。见表3。

表3 肠组织SIgA含量和行为学实验结果

2.3肠道可培养微生物的培养结果4组小鼠需氧菌和酵母菌菌落数差异具有统计学意义，需氧菌菌落美沙酮组显著小于0.9%氯化钠组和抗生素组；酵母菌菌落0.9%氯化钠组显著大于其他3组（P＜0.05）。肠组织SIgA含量与酵母菌菌落数存在正向相关关系（P=0.011，r=0.248）。见表4。

表4 肠道可培养微生物的培养结果

3 讨论与结论

实验期间，各组小鼠的平均食量、体质量以及饲养环境和条件无差异，小鼠模型可以很好地控制其他混杂因素对肠道菌群的影响，因此采用小鼠模型探讨美沙酮对肠道正常菌群和菌群失调的小鼠行为和肠道微生态影响是有效可行的。多项研究显示接受MMT的海洛因成瘾者免疫功能发生变化，例如美沙酮可诱导CCR5（C-C趋化因子受体5型）的表达，采用美沙酮处理的CEM x174淋巴细胞中CCR5的mRNA和蛋白均升高；MMT的海洛因成瘾者免疫细胞中μ和δ阿片受体mRNA的表达明显下降，慢性阿片类药物暴露与人淋巴细胞中G-蛋白偶联的阿片受体基因表达的下调有关〔8-9〕。近年来的研究显示和肠道菌群相关的疾病研究包括消化道类、代谢性、肝脏类、免疫类、肺部和精神类疾病等〔10-12〕。肠道菌群不仅在健康和疾病中发挥着重要作用，菌群失调还会影响药物的作用效果〔13〕。小鼠肠道菌群发生变化会影响其对吗啡的敏感性，口服抗生素显著减少了小鼠肠道菌群，并抑制了吗啡诱导的肠道通透性增加、结肠黏膜损伤及结肠IL-1β（白细胞介素1β）的表达，同时抑制了小鼠对吗啡镇痛作用的耐受性〔14〕。此外，肠道菌群改变还可影响小鼠对可卡因的行为反应，抗生素处理可提高小鼠对可卡因的敏感性，给这些小鼠补充短链脂肪酸可以降低其对可卡因的偏好〔15〕。胃肠淋巴组织富含淋巴细胞，也是人体发挥免疫功能的重要场所，MMT对机体免疫功能的影响是否会进而影响肠道微生态，并且美沙酮与吗啡药效类似，作为阿片类毒品成瘾的替代维持治疗药物，菌群失调是否也会影响其作用效果。

SIgA是由肠道黏膜固有层（LP）浆细胞分泌的一种重要的免疫球蛋白，在肠道内具有中和毒素、抑制细菌增殖、抵抗蛋白溶解酶等作用，是肠道防御系统的第一道防线，其含量变化能够反映肠黏膜局部免疫状态〔16-17〕。一方面，肠道黏膜免疫系统持续接受病原体、肠内共生菌、食物蛋白等信号刺激，并通过一套严格的调节机制来区分危险信号和无害信号，并对危险信号进行应答〔18〕。另一方面，黏膜局部产生的SIgA又可调节肠道微生态系统的组成和功能，阻止病原菌及其毒素对肠黏膜的攻击，一旦SIgA缺失或功能障碍将会引起肠道菌群组成成分的变化〔19〕。本研究显示美沙酮处理后小鼠肠道需氧菌和兼性厌氧菌、酵母菌减少，提示美沙酮对小鼠肠道菌群的构成有影响。抗生素、美沙酮以及两因素共同处理后肠黏膜局部免疫功能下降，且SIgA含量和酵母菌菌落数存在正向相关关系，提示这些因素对肠黏膜局部免疫功能的影响可能与肠道酵母菌相关，但究竟是肠道菌群组成的变化影响了肠道黏膜免疫功能，还是肠道黏膜免疫功能的改变影响了肠道菌群组成，亦或是两者互为因果相互影响还需进一步研究。

肠道菌群通过肠-脑轴对宿主的应激反应、焦虑、抑郁行为和认知功能产生重要影响，平衡的肠道菌群可以促进宿主的身心健康，而肠道菌群失调则可能引发肠-脑疾病（如肠易激综合征、炎性肠道疾病和肝性脑病）和中枢神经系统疾病（如多发性硬化症、阿尔茨海默症和自闭症等）〔20〕。悬尾试验能直接反映小鼠的体能状态、激惹和绝望程度，小鼠处于一个不能逃避的应激环境，当其处于绝望状态时会放弃挣扎，表现出抑郁状态，因此可以用不动时间来判断其抑郁状态，不动时间越长说明抑郁状态越严重。旷场实验又称敞箱实验，是评价实验动物在新环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法，水平穿越格数反映动物的兴奋性和探究性，直立次数反映动物对环境的适应程度〔5，21〕。本研究结果显示美沙酮对肠道菌群失调小鼠的行为有影响，表现为更少的抑郁状态和对环境更强的适应程度，提示肠道菌群失调会影响美沙酮对小鼠的作用效果，为美沙酮的研究提供了肠道微生态的新视角。

本研究未对肠道中厌氧菌进行培养分析，行为学实验人工观察存在一定误差，这是本研究的不足之处，有待下一步深入研究肠道菌群对美沙酮依赖的影响以及具体作用机制。