lncRNA AB07361在冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血清中的表达及意义*

王延震，李 炯，甘义荣，寇宗科，张云龙，梁天香，冒 锐，谢定雄△

1甘肃省心血管病研究所，兰州 7300502兰州大学基础医学院，兰州 730000

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease，CAD)又称为缺血性心脏病、冠心病，是严重的心血管疾病之一，亦为人类重要死亡原因之一[1-2]。仅2015年世界范围内有1.1亿的新发冠心病患者，死亡高达890万人。目前我国冠心病患者约有1100万人，其病死率呈上升趋势[3]。动脉粥样硬化为多数心血管疾病的病理基础，受遗传、免疫紊乱、慢性炎症及脂质代谢异常等因素影响，其病程涉及脂质在血管内膜沉积、内皮细胞受损、血小板和白细胞(单核细胞)粘附、侵袭伴平滑肌细胞和胶原纤维增生、泡沫细胞形成等。CAD的发病机制较为复杂，其危险因素包括高血压、冠心病家族史、高脂血症、吸烟、肥胖等[4]。相关研究表明，胰岛素样生长因子2B mRNA(IGF2B mRNA)通过结合蛋白参与动脉粥样硬化炎症反应，而长链非编码RNA(lncRNA)已被证实可能具有调控IGF2B mRNA蛋白表达的作用，本研究旨在探讨lncRNA AB07361在CAD患者血清中的表达及其临床意义。以期为明确影响CAD病理生理进程的相关调控机制，对CAD患者实行早诊断，有效降低其病死率而提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2017年3月～2019年6月于甘肃省心血管病研究所行冠状动脉CT或冠脉造影符合纳入条件的CAD患者96例为CAD组，其中男性41例、女性55例，平均年龄(62.73±10.41)岁；同时选取同期住院的非CAD患者96例为对照组，其中58例女性、38例男性，平均年龄(63.12±10.64)岁。患者均行造影或冠脉CT检查，对右冠状动脉、左前降支、左回旋支、左主干等主要血管至少予以3处多体位测定，若结果显示狭窄超过直径50%的血管>1支，即可确诊为冠状动脉粥样硬化性心脏病(CAD)。排除肿瘤患者、急慢性感染性疾病者、严重肝肾功能损坏者、周围血管性疾病及血液系统疾病患者、瓣膜性心脏病患者、心律失常者。此研究经我所伦理委员会批准通过，受试者均知情并签署同意书。两组患者血糖、血脂、血压水平、体重、身高、年龄、性别等一般临床资料具有可比性(表1)。

1.2 血液样品采集

受试者清晨7：00空腹抽肘静脉血7 mL，并将血液样本置于EDTA抗凝管中，4℃下3000 r/min离心15 min，取上清液备用。

1.3 应用测序方法对9p21基因区域3种单核苷酸多态性进行分型

提取受试血液样本基因组DNA，PCR扩增9p21含3种单核苷酸(rs1333049、rs564398、rs2811712)多态性位点的区域，应用测序方法分型。在20 μL的PCR扩增体系中，加入1 μL基因组DNA后在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems9600上设置程序：95℃变性15 min；95℃30 s、56℃1 min、72℃1 min，35个循环；72℃延伸7 min。在PCR扩增产物中加入等体积ddH2O稀释，作为连接反应的模板，在1.5 mL Eppendorf离心管中分别加入100 μL buffer(×10)，100 μL Probe Mix，5 μL连接酶，695 μL去离子水。混匀后取9 μL分装在200 μL的PCR反应管中，最后再加入1 μL PCR反应产物，在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems9600上设置程序：95℃变性2 min；94℃30 s、56℃1 min，35个循环；50℃2 min。将PCR反应管放入PCR仪中进行连接反应，各取1 μL LDR连接产物与1 μL ABI GS-500ROX荧光标记分子量标准和1 μL去离子甲酰胺上样液混合，95℃加热变性2 min，冰中骤冷，在5%聚丙烯酰胺和5 mol/L尿素中3000 V电泳2.5 h，应用GENESCAN672软件对数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和矫正内在分子量标准，应用Genemapper软件进行数据分析和基因分型。

1.4 qRT-PCR法测定外周血中lncRNA AB07361等的表达

在人类基因组上，AB07361、CDKN2A、CDKN2B基因在9p21染色体上连锁排列，是细胞转化生长因子的调控区域，因此本次研究从GenBank获得AB07361、CDKN2A、CDKN2B、GAPDH序列，采用Primer 6.0软件设计引物(表2)。建立10 μL反应体系：cDNA 2 μL，ddH2O 1 μL，上下游引物(由武汉金凯瑞公司合成)各1 μL，2×SYBR GREEN Master Mix 5 μL。设置RT-PCR反应条件为：95℃反应30 s；95℃反应10 s、60℃反应30 s，35个循环。目的基因表达水平采用2-ΔΔCt法计算。

表2 lncRNA各引物序列Table 2 Primer sequences of lncRNA

1.5 统计学分析

数据处理采用SPSS 23.0软件和GraphPad Prism系统，两组间均数比较采用独立样本t检验。计数资料以百分比(%)表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者外周血中lncRNA AB07361表达水平比较

qRT-PCR结果表明，在CAD患者外周血中lncRNA AB07361的相对表达量显著高于非CAD患者，(4.352±0.223)vs.(1.623±0.145)，P<0.05。

2.2 lncRNA AB07361表达水平对CAD诊断的效能

ROC分析lncRNA AB07361的表达见图1，当Cut-off值为3.026，曲线下面积(AUC)值为0.883时，诊断CAD的特异度为85%，灵敏度为75%。

2.3 比较CAD与9p21区域多态性单核苷酸的相关性

分析测定了对照组及CAD组9p21基因区域3种单核苷酸rs1333049、rs564398、rs2811712的等位基因分布情况。结果表明：在两组受试者中rs1333049、rs564398、rs2811712的等位基因频率差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.4 lncRNA AB07361表达与rs1333049等位基因G频率的关联性

对CAD组lncRNA AB07361(外显子17-18)、lncRNA AB07361(外显子1-2)与rs1333049等位基因G频率的相关性进行分析，发现两者均呈正相关(r=0.341，0.313，均P<0.05)，见图2。

2.5 lncRNA AB07361表达与CDKN2A、CDKN2B表达的关联性

分别对冠心病组lncRNA AB07361表达与CDKN2B、CDKN2A表达的相关性进行分析，结果显示：lncRNA AB07361(外显子17-18)表达与CDKN2A的表达呈正相关(r=0.548，P<0.01)，而与CDKN2B的表达无相关性；lncRNA AB07361(外显子1-2)与CDKN2A、CDKN2B表达均呈正相关(r=0.652，0.518，均P<0.05)，见图3。

图1 ROC分析lncRNA AB07361的表达Fig.1 Expression of lncRNA AB07361 by ROC analysis

表3 两组患者单核苷酸等位基因频率比较[例(%)]Table 3 Comparison of single nucleotide allele frequencies between the two groups[n(%)]

图2 rs1333049等位基因G频率与lncRNA AB07361表达的相关性分析Fig.2 Correlation analysis of rs1333049 allele frequency G and lncRNA AB07361 expression

图3 lncRNA AB07361与CDKN2A、CDKN2B相关性分析Fig.3 Correlation analysis between lncRNA AB07361 and CDKN2A，CDKN2B

3 讨论

为提高冠心病患者早期诊断率，实现早期治疗，改善患者临床症状，寻找新的生物标志物和治疗靶点成为最新研究方向[5]。lncRNA是拥有200个以上核苷酸的RNA分子，其可从转录及转录后多层面地对基因表达进行调控，同时影响信号分子通路，因而在分子生物学领域备受关注[6]。lncRNA较mRNA表达水平低，但诸多证据表明，lncRNA在胚胎干细胞发育和分化过程中起关键作用。全基因组研究显示，lncRNA为细胞特异性，可反映表观遗传学的作用[7]。lncRNA参与了血管生成与功能、炎症反应、斑块的形成、脂质沉积、血管平滑肌细胞的迁移和增殖等调节过程，而冠心病的发生、发展及预后则与其异常表达相关。

单核苷酸在染色体9p21区域中表达极为丰富，其通常与疾病密切相关，临床中包括动脉粥样硬化性疾病、心肌梗死、颅内动脉瘤等在内的心血管疾病，以及内分泌代谢疾病如2型糖尿病等均与该区域有关[8-9]。同时它还与皮肤痣、黑色素瘤、牙周炎和阿尔茨海默病、白血病和青光眼等远缘病因的疾病亦存在关联[10-11]。全基因组关联研究(GWAS)目前也已确定染色体9p21区域遗传变异的基因与心血管疾病的发生具有密切关联[12]。鉴于此，本研究对CAD组及对照组患者9p21区域的rs1333049、rs564398和rs2811712等3种单核苷酸表达水平进行检测，分析了其不同基因型在CAD患者中的差异性表达。结果表明：在两组受试者中rs1333049、rs2811712与rs564398等位基因频率差异均无统计学意义。

近期研究表明，lncRNA可通过调节基因的增强子和启动子对周围基因表达进行调节，可以从转录调控及转录后调控、表观遗传学等多个方面调控基因表达，从而对细胞的增殖、凋亡和损伤、自噬予以调节，以此参与疾病的发生和发展过程[13-14]。

本研究结果显示：① lncRNA AB07361在CAD患者外周血中的相对表达量显著高于非CAD患者。采用ROC分析，AUC为0.883，以此判断lncRNA AB07361可作为辅助诊断CAD的分子标志物，其诊断CAD的特异度为85%，灵敏度为75%时，Cut-off值为3.026。但本研究对象局限于单一地区的汉族人群，且所纳入样本量偏少，我们将在后续的研究中扩大研究样本量，进而明确是否可以将lncRNA AB07361作为诊断CAD的分子标志物。②冠心病患者lncRNA AB07361(外显子17-18)、AB07361(外显子1-2)与rs1333049等位基因G频率均呈正相关。③lncRNA AB07361(外显子17-18)与CDKN2A的表达呈正相关，lncRNA AB07361(外显子1-2)与CDKN2A、CDKN2B表达呈正相关。

总之，lncRNA AB07361或通过调控CDKN2A、CDKN2B的表达而影响CAD的发生发展，而lncRNA AB07361的表达可能受染色体9p21区域单核苷酸rs1333049表达的影响。lncRNA AB07361或可成为早期鉴别和诊断CAD的分子标志物，在临床上具有良好应用前景，但其具体机制仍需进一步深入研究。