沉默信息调节因子6介导的IGF1R/AKT通路在非小细胞肺癌中的调节机制*

蒲江涛，唐小军，胡 智，张登国，张 涛，戴天阳

西南医科大学附属医院胸外科,泸州 646000

肺癌是较为常见的恶性肿瘤，近年来肺癌发病率呈上升趋势，由肺癌所导致的死亡率居各种癌因死亡的首位[1]。肺癌可分为小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)两大类，NSCLC约占肺癌的80%[2]，尽管针对NSCLC的治疗方法已经取得了长足的进步，然而随着肿瘤耐药的日趋严重，NSCLC患者5年生存率仍较差，因此寻找NSCLC有效分子标志物以及潜在治疗靶点，对改善NSCLC患者预后具有重要的临床意义。哺乳动物中的Sirtuin(SIRT)家族在细胞增殖、衰老调控、肿瘤发生发展等多个方面发挥着重要的作用[3]。SIRT6是SIRT家族中的一员，目前已被证实在胰腺癌和乳腺癌的发生发展中起作用[4-5]。胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)通过抑制肿瘤细胞凋亡调控肿瘤发展[6]。在肿瘤细胞进入G1期后，IGF1R可促使细胞进入G2/M期，促进肿瘤细胞增殖，而这一作用是通过调控其下游的AKT表达完成的[7]。Takasaka等[8]研究发现，SIRT6可通过减弱IGF1R/AKT信号传导的自噬诱导参与人支气管上皮细胞衰老。考虑到NSCLC中AKT通路的异常激活[9]，我们推测SIRT6具有抑制NSCLC进展的潜能，但SIRT6在NSCLC中的作用及相关机制却鲜见报道。基于此，本研究通过检测NSCLC癌组织、癌旁组织及NSCLC细胞A549、人支气管上皮细胞16HBE中SIRT6表达，并在A549细胞中干扰/过表达SIRT6，检测细胞增殖和凋亡及IGF1R、AKT表达情况，探讨SIRT6在NSCLC发生发展中的作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 标本采集

收集2018年12月至2019年1月期间，经我院手术治疗的12例NSCLC患者癌组织及距肿瘤切缘2 cm以上的癌旁组织(镜下观察未见癌细胞)，样本取出后立即置于液氮中保存。纳入标准：①病理学证实为NSCLC；②术前未接受放疗、化疗或其他抗癌治疗；③患者临床资料完整。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②合并除NSCLC外的其他慢性消耗性疾病。本研究经医院伦理委员会批准；所有患者术前均签署知情同意书。其中，男性7例，女性5例，年龄范围46～75岁，平均年龄(56.25±11.15)岁。

1.2 细胞来源与培养

NSCLC细胞A549以及人支气管上皮细胞16-HBE均购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。上述细胞均接种于RPMI 1640培养液(含100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素和10%胎牛血清)，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3 实验试剂

RPMI 1640培养液、胎牛血清(美国Gibco公司)；Lipofectamine 2000转染试剂、TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司)、PrimeScript RT试剂盒(日本TaKaRa公司)；Tris-Base(美国Sigma公司)、SIRT6抗体、IGF1R抗体、AKT抗体、二抗、β-actin抗体(美国Sigma公司)；SDS-PAGE试剂盒(碧云天公司)；BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司)；重组腺病毒(Ad-SIRT6、GFP-SIRT6、Si-SIRT6、Si-NC)(上海汉恒公司)；TUNEL试剂盒(美国Promega公司)；CCK-8试剂盒(日本DOJINDO公司)；引物设计委托Invitrogen公司完成。

1.4 实验方法

1.4.1 RNA提取与实时荧光定量(qPCR)检测 采用TRIzol试剂盒提取组织和细胞中RNA，按照PrimeScript试剂说明书逆转录为cDNA。采用qRCP检测SIRT6表达。反应条件：95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 30 s，40个循环。反应结束后获得熔解曲线和扩增曲线。SIRT6相对表达量以β-actin作为内参照，SIRT6引物：上游5′-CCGGAATTCGGCTAATGTGGCAGTCCTCC-3′；下游5′-CGCGGATCCAGGTCCCGGGTCAGCTGG-3′。β-actin引物：上游5′-GCACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3′；下游5′-CCGCCAGACAGCACTGTGTT-3′。反应结束后计算每个基因的循环阈值(Ct)，采用2-ΔΔCt进行计算，并与β-actin比较，确定SIRT6 mRNA相对表达水平。ΔCt=Ct(SIRT6)-Ct(β-actin)，ΔΔCt=ΔCt(癌组织)-ΔCt(癌旁组织)。IGF1R、AKT mRNA检测方法同上，IGF1R引物：上游5′-GTGGGGGCTCGTGTTTCTC-3′；下游5′-GATCACCGTGCAGTTTTCCA-3′；AKT引物：上游5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′；下游5′-CT-CCTTAATGTCACGCACGAT-3′。

1.4.2 Western blot检测蛋白表达 取适当肿瘤组织和癌旁组织，剪碎后匀浆，加入裂解液200 μL裂解约30 min后，低温离心(12000 r/min，4℃)，吸取上清液分装。针对细胞株，所有操作均在冰上进行，原理与步骤与组织蛋白提取类似。测定蛋白质浓度，配置8% SDS-PAGE分离胶、5% SDS-PAGE浓缩胶，取10 μL样品上样，80～120 V电压下进行电泳。转膜后加入一抗，4℃过夜。加入二抗(1∶5000稀释)后，37℃摇床中孵育1.5 h，进行发光显影扫描记录数据。

1.4.3 调节A549细胞SIRT6表达 Ad-SIRT6是SIRT6过表达载体、GFP-SIRT6是Ad-SIRT6对照空载体、Si-SIRT6是SIRT6干扰载体、Si-NC是Si-SIRT6对照空载体。将A549细胞分为4组，分别用上述载体进行感染，并设置为过表达组(Ad-SIRT6)及其对照组(GFP-SIRT6)、干扰组(Si-SIRT6)及其对照组(Si-NC)。选取对数期生长良好的A549细胞，经消化后接种于6孔板中，使每孔细胞数为1×105～2×105个，向每孔中加入RPMI 1640培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞密度达到50%～70%时，加入已经扩增好的腺病毒上清1 mL，继续置于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，备用。同时设置16HBE细胞干扰组进行对照。SIRT6上游：5′-GATCCGGTCTGGCAGT-CTTCCAGTGTTTCAAGAGAACACTGGAAG-ACTGCCAGACCTTTTTTG-3′，下游：5′-GCC-AGACCGTCAGAAGGTCACAAAGTTCTCTT-GTGACCTTCTGACGGTCTGGAAAAAAACT-TAA-3′；Si-SIRT6上游：5′-GCCGUCUGGUUGUCAATT-3′，下游：5′-UUGACAAUGAGACGG-CTT-3′。

1.4.4 细胞增殖实验 用CCK-8试剂盒检测细胞增殖，将转染的细胞接种于96孔板(2×103个细胞/孔)，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。检测前2 h向每孔中加入10 μL CCK-8试剂(5 mg/mL)；分别于培养12、24、36、48 h后采用酶标仪检测450 nm处吸光度值(A值)。

1.4.5 细胞凋亡实验 细胞培养48 h后，采用TUNEL试剂盒检测细胞凋亡，收集细胞，PBS洗涤1次后，4%多聚甲醛溶液固定45 min，再次PBS洗涤，0.1% Triton X-100+PBS重悬细胞，冰浴2 min，加入50 μL TUNEL检测液，37℃下避光孵育45 min，PBS洗涤后，激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况并计数。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 SIRT6在NSCLC组织和细胞中的表达

癌组织SIRT6 mRNA相对表达量(0.289±0.187)明显低于癌旁组织(0.967±0.282)，差异具有统计学意义(t=6.941，P<0.01)，详见图1A；SIRT6蛋白相对表达量(0.433±0.089)明显低于癌旁组织(1.067±0.106)，差异具有统计学意义(t=15.868，P<0.01)，详见图1B；A549中，SIRT6 mRNA相对表达量(0.373±0.092)明显低于16HBE(1.012±0.183)，差异具有统计学意义(t=6.976，P<0.01)，详见图1C；SIRT6蛋白相对表达量(0.383±0.092)明显低于癌旁组织(1.037±0.116)，差异具有统计学意义(t=9.877，P<0.01)，详见图1D。

A：癌组织、癌旁组织SIRT6 mRNA相对表达量；B：癌组织、癌旁组织SIRT6蛋白相对表达量；C：A549、16HBE SIRT6 mRNA相对表达量；D：A549、16HBE SIRT6蛋白相对表达量；**P<0.01图1 SIRT6在NSCLC组织和细胞中的表达Fig.1 SIRT6 expression in NSCLC tissues and cells

2.2 重组腺病毒感染A549细胞对SIRT6蛋白表达的影响

构建A549细胞过表达组(Ad-SIRT6)及其对照组(GFP-SIRT6)、干扰组(Si-SIRT6)及其对照组(Si-NC)，同时选取16HBE细胞(Si-SIRT6-16HBE组)作为对照。Western blot检测各组细胞SIRT6蛋白表达情况，详见图2A。以β-actin条带为参照，进一步分析结果显示，Ad-SIRT6组SIRT6蛋白表达高于其他各组，差异具有统计学意义(均P<0.05)，可以进行后续研究，详见图2B。

2.3 SIRT6对细胞生物学功能的影响

CCK-8法检测细胞增殖，结果显示，24、36、48 h时，Ad-SIRT6组细胞增殖能力明显低于Si-SIRT6组细胞，差异具有统计学意义(P<0.01)。Si-SIRT6-16HBE组细胞增殖能力明显高于Si-NC-16HBE组细胞，差异具有统计学意义(P<0.01)。这一结果说明，SIRT6可抑制A549、16HBE细胞增殖能力，详见图3。

①：Si-SIRT6；②：Si-SIRT6-16HBE；③：Ad-SIRT6；④：Si-NC-16HBE；⑤：GFP-SIRT6；⑥：Si-NC； *P<0.05图2 重组腺病毒感染A549细胞对SIRT6蛋白表达的影响Fig.2 Effect of recombinant adenovirus-infected A549 cells on the expression of SIRT6 protein

Ad-SIRT6组与Si-SIRT6组比较,a P<0.01；Si-SIRT6-16HBE组与Si-NC-16HBE组比较,b P<0.01图3 SIRT6对A549、16HBE细胞增殖能力的影响Fig.3 Effect of SIRT6 on proliferation of A549 and 16HBE cells

2.4 细胞凋亡情况

Ad-SIRT6组凋亡细胞数明显高于Si-SIRT6组细胞，差异具有统计学意义(P<0.01)。Si-SIRT6-16HBE组凋亡细胞数明显高于Si-NC-16HBE组，差异具有统计学意义(P<0.01)，详见图4。

A：Ad-SIRT6组；B：Si-SIRT6组；C：Si-SIRT6-16HBE组；D：Si-NC-16HBE组；**P<0.01图4 SIRT6对A549、16HBE细胞凋亡的影响Fig.4 Effect of SIRT6 on apoptosis of A549 and 16HBE cells

2.5 SIRT6对A549细胞IGF1R、AKT表达影响

由于IGF1R可通过调控其下游AKT表达，进而发挥抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖的作用，并且，如前所述，SIRT6与IGF1R、AKT关系密切。因此，为了探讨干扰/过表达SIRT6对A549细胞IGF1R、AKT表达的影响，此部分选取A549细胞(设置为Mock组)作为对照进行研究。结果显示，Si-SIRT6组IGF1R、AKT mRNA和蛋白均明显高于Mock组和Ad-SIRT6组，而上调SIRT6的Ad-SIRT6组，其IGF1R、AKT mRNA和蛋白均明显低于其余两组(均P<0.01)。说明与未进行干扰/过表达的A549细胞相比，下调SIRT6可增加A549细胞IGF1R、AKT表达，反之，上调SIRT6能降低A549细胞IGF1R、AKT表达，详见图5。

**P<0.01图5 SIRT6对A549细胞IGF1R、AKT表达的影响Fig.5 Effect of SIRT6 on expression of IGF1R，AKT proteins in A549 cells

3 讨论

人类与沉默信息调节因子家族密切相关的蛋白有7个，分别是SIRT1～SIRT7，它们在细胞中定位不同，发挥着不同的作用，但均与衰老和肿瘤的发生发展密切相关[10]。新近研究表明，SIRT6广泛参与衰老、转录调控、mRNA加工等生物学过程[11]。在肿瘤的形成和发展过程中，SIRT6发挥着重要作用。Sebastián等[12]在一项临床样本分析中指出，SIRT6在肿瘤细胞中通过调控糖酵解发挥抑癌作用。Zhang等[13]和Zhang等[14]在同年分别从不同的角度报道了SIRT6表达水平与卵巢癌分化程度和卵巢癌患者预后明显相关。有趣的是，SIRT6在乳腺癌的发生发展过程中同时扮演着癌基因和抑癌基因双重角色[5，15]。在NSCLC方面，Han等[16]的研究显示，癌组织中SIRT6的表达明显低于正常组织，其机制可能与SIRT6抑制上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)转录因子Twist 1的表达进而抑制NSCLC细胞增殖有关。而也有研究认为，SIRT6降解的增加，会提高肺癌对放疗的敏感性，降低SIRT6会增加肺腺癌对化疗的敏感[17-18]。由此可见，SIRT6在众多肿瘤的发生过程中均起着重要的作用，但作用却不尽相同，作用机制较为复杂。

本研究结果显示，癌组织SIRT6 mRNA、SIRT6蛋白相对表达量明显低于癌旁组织，同时，A549 SIRT6 mRNA、SIRT6蛋白相对表达量也明显低于16HBE。这说明，在NSCLC中，SIRT6可能起着抑癌基因的作用。为了进一步验证这一结果，本研究进行了细胞学水平的分析，在构建干扰/过表达SIRT6细胞后，利用CCK-8法检测细胞增殖，利用TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果发现，干扰表达SIRT6的细胞增殖能力明显高于过表达组的细胞，过表达SIRT6的细胞凋亡数明显高于干扰表达组的细胞。这一结果说明，SIRT6具有抑制A549细胞增殖，促进A549细胞凋亡的作用。

众多研究证实，IGF1R是PI3K-AKT的上游调控分子，参与细胞的代谢、增殖和凋亡[19]。本研究通过观察IGF1R、AKT表达情况，以探讨SIRT6在NSCLC发生发展中的作用及可能的机制。结果发现，过表达SIRT6的A549细胞，其IGF1R、AKT mRNA和蛋白水平均明显低于干扰表达组。这提示，SIRT6可下调IGF1R、AKT表达。结合前面的研究结果，我们推测，SIRT6可抑制IGF1R-AKT通路活化，进而发挥其抑癌基因的作用，这将为研究NSCLC早期诊断及靶向治疗提供初步的理论基础。

综上所述，SIRT6在NSCLC组织和细胞中呈现低表达，SIRT6可能通过抑制IGF1R/AKT信号通路的异常活化，阻止A549细胞的增殖，促进A549细胞的凋亡。但是本研究仅提出了SIRT6、IGF1R、AKT在调节NSCLC生物学功能中的可能性，由于SIRT6具有极为复杂的功能，因此具体调控机制及其调控过程中是否有其他靶基因参与仍需要进一步证实。