TLR4单克隆抗体对过敏性紫癜小鼠损伤的保护作用及其机制*

贵 琳，朱松柏，郑荣浩，舒 岚，朱宏飞，王 勇，吴晓林△

1湖北省妇幼保健院儿童肾病风湿免疫科，武汉 4300702湖北省中医药研究院，湖北省中医院麻醉科，武汉 4300613武汉大学动物实验中心，武汉 430071

过敏性紫癜，又被称为亨诺-许兰综合征(Henoch-Schonlein purpura，HSP)，是以全身小血管炎症为主要病变的系统性血管炎，以皮肤出现青紫瘀斑为主要临床表现，随着病情发展可累及胃肠道、关节及肾脏等多个系统，严重威胁患者的身心健康[1]。此病好发于3～10岁的适龄儿童，有研究报道其发病率为0.14‰～0.22‰，且男性多于女性[2-3]。迄今，该病的病因及发病机制尚不完全清楚，可能涉及感染、药物、遗传以及饮食等多种诱发因素[4]。其中，免疫功能失衡可能为HSP的主要病理机制之一，主要是由自身免疫应答机制的紊乱所致，很多研究表明，在HSP患者体内的多项免疫指标均有显著变化[5]。

研究证明，Th17细胞可通过分泌IL-17等促炎症因子介导一系列炎症反应、自身免疫性疾病以及异体移植排斥反应的发生发展过程[6]。而以CD4+CD25+Treg为主的Treg细胞是一组具有免疫抑制功能的T细胞，对异体移植排斥和自身免疫性疾病等具有重要的调节作用[7]。在正常情况下，均来源于初始CD4+T细胞的Th17和Treg保持平衡状态；而在炎症反应或自身免疫性疾病发生时，以IL-6为主的促炎症因子异常表达会影响CD4+T细胞的分化格局，破坏Th17/Treg平衡，进而导致机体一系列损伤[8]。相关研究还显示，Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)在HSP患儿体内存在异常活化，尤其是累及肾损伤的患者，血清TLR4水平异常偏高，提示其可能通过调节免疫应答机制参与了HSP的发病过程[9]。本研究在以往研究的基础之上，建立HSP小鼠模型，并采用TLR4单克隆抗体进行治疗，从网状内皮系统(reticuloendothelial system，RES)功能、炎症因子水平和病理学变化等多角度进行探讨，研究其对HSP小鼠的保护作用以及相关机制，为HSP的临床免疫治疗奠定一定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究中的动物实验均符合国家相关法律和动物伦理学要求，所有实验在武汉大学动物实验中心完成。选取50只健康雄性C57BL/6小鼠(7～9周龄,体重20～25 g)，饲养于以下条件：照明/黑暗周期为12/12 h(光照时间8：00～20：00)，温度为(22±3)℃，湿度为(52±3)%，不限制摄食和饮水。

1.2 试剂及仪器

造模试剂：麦胶蛋白(Gliadin)购自东京化成工业株式会社，用时配制成含0.1%Gliadin、6 mmol/L HCl的酸化水；印度墨水购自北京西中化工厂。

治疗药物：兔抗小鼠TLR4 mAb(货号：MAB2759)及同型对照抗体兔IgG2A(货号：MAB006)购自R&D公司；阳性对照药物西咪替丁(国药准字H20058427)购自国药集团，用时以0.9%氯化钠注射液配制成0.1 g/mL溶液。

检测试剂：小鼠外周血单核细胞分离液试剂盒(货号E501094)购自上海生工公司；抗小鼠FITC-CD4抗体(货号：11-0042-82)、抗小鼠PE-IL-17抗体(货号：45-7177-82)及抗小鼠PE-CD25抗体(货号：12-0251-82)购自eBioscience公司；小鼠血清ELISA检测试剂盒：S-IgE(货号：MU30943)、IL-17(货号：MU30074)、IL-6(货号：MU30044)、IL-10(货号：MU30055)和TGF-β(货号：MU30574)均购自Bio-Swamp公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购自TaKaRa公司；SYBR Green染料购自Lumiprobe Corporation公司；BCA蛋白定量试剂盒(货号：A045-3)及全蛋白提取试剂盒(货号：W034)购自南京建成公司；兔抗鼠GAPDH抗体(货号：2118)购自CST公司；兔抗小鼠TLR4抗体(货号：19811-1-AP)、山羊抗兔IgG二抗(货号：10285-1-AP)购自武汉三鹰公司；兔抗小鼠IL-17抗体(货号：MAB421)购自R&D公司。

主要仪器：Real-time System荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)；酶标仪(Bio-Tek，美国)；流式细胞仪(Beckman，美国)等。

1.3 小鼠HSP模型构建

将小鼠适应性饲养1周后开始实验。选取50只小鼠，随机分为5组：正常对照组、HSP模型组、同型对照组、TLR4 mAb组和西咪替丁阳性对照组，每组10只。参照赵志华等[10]的HSP动物造模法，正常对照组：灌胃小鼠6 mmol/L的HCl酸化水(不含Gliadin)，灌胃量为0.5 mL/只，隔日灌胃1次，持续到14周末。其余4组：实验前3周以0.4 mg/10 g的量于尾静脉注射印度墨水，每周注射1次；持续3周后，灌胃0.1% Gliadin、6 mmol/L HCl酸化水，0.5 mL/只，隔日灌胃1次，持续至14周末。其中，在造模的最后3 d，将1 mg Gliadin加入到含5 mmol/L HCl酸化水的pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，给小鼠尾静脉注射0.2 mL/只，每天1次，连续3 d。14周末处理结束。

1.4 药物干预

模型构建成功后，对各治疗组小鼠进行对应药物干预，持续3周。同型对照组小鼠腹腔注射非特异性兔IgG2A，剂量为100 μg/(kg·d)；TLR4 mAb组小鼠腹腔注射TLR4 mAb，剂量为100 μg/(kg·d)；阳性药物对照组小鼠腹腔注射西咪替丁注射液，剂量为30 mg/(kg·d)；而正常对照组和模型组小鼠均在腹腔注射等体积生理盐水(20 mL/kg)。药物干预处理3周后，取材检测。

1.5 尿蛋白含量检测

干预结束后，用代谢笼收集各组小鼠的24 h尿液，并通过尿蛋白试剂盒(CBB法)进行定量，尿蛋白的浓度(mg/L)=(测定A值-空白A值)/(标准A值-空白A值)×标准品的浓度(563 mg/L)。

1.6 小鼠RES功能检测

干预结束后，以印度墨汁小鼠碳粒廓清法[11]检测各组小鼠RES功能。实验操作步骤：将印度墨汁稀释10倍后，于小鼠尾静脉注射0.05 mL/10 g稀释后的印度墨汁，分别在注入2 min(t1)和12 min(t2)眼眶取血0.02 mL，将血溶入浓度为0.1% Na2CO3溶液中摇匀。以等量0.1% Na2CO3溶液为对照。在波长640 nm处检测两个时间点的吸光度值(A1和A2)。小鼠麻醉并称体重，采集静脉血液、皮肤及肾脏组织保存，并摘取肝脏、脾脏称重，计算吞噬指数K和吞噬系数α。其中K=(lgA1-lgA2)/(t2-t1)；α=K1/3×体重/(肝重+脾重)。

1.7 小鼠外周血单核细胞的Th17和Treg细胞分选

采集各组小鼠新鲜外周血，按小鼠外周血单核细胞分离液试剂盒操作制备单核细胞悬液，后经流式细胞术检测外周血单核细胞悬液中CD4+IL-17+T细胞(Th17)及CD4+CD25+T细胞(Treg)分别占CD4+T细胞的百分比，并计算各组Th17/Treg细胞比值。

1.8 小鼠血清S-IgG、IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β水平检测

将血液3000 r/min离心10 min后，取血清；采用ELISA检测试剂盒分别检测各组小鼠血清中S-IgE含量以及炎症细胞因子IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β的水平。

1.9 小鼠皮肤和肾脏中RORγt及Foxp3在mRNA水平上的检测

根据NCBI上公布的小鼠视黄酸相关性孤儿受体(retinoic acid associated orphan receptor γt，RORγt)、叉头样转录因子3(forkhead helix transcription factor 3，Foxp3)基因及内参基因GAPDH序列分别设计qRT-PCR引物：RORγt 上游5′-C-GCGGAGCAGACACACTT-3′，下游5′-CTGGACCTCTGTTTTGG-3′；Foxp3上游5′-GCTGCCTACAGTCCCCTA-3′，下游5′-TTTGCCAGCAGTGGGTA-3′；GAPDH上游5′-GTCGTACCACAGGCATTG-3′，下游5′-CAATGCCTGGGTACATGG-3′；并由上海生工公司合成提供。采用2-ΔΔCt表示基因的相对表达量。

1.10小鼠皮肤和肾脏中相关蛋白表达量检测

提取各皮肤和肾脏组织总蛋白，以蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度。取20 μg蛋白和4 μL 2×SDS上样缓冲液混合均匀，高温变性10 min；上样，转膜；以5%脱脂牛奶封闭1 h；用PBS冲洗；分别加入一抗(TLR4，1∶800；IL-17，1∶1000；GAPDH，1∶1000)，4℃恒温孵育过夜；用PBS冲洗；添加二抗(1∶5000)25℃孵育0.5 h，用PBS冲洗；显色。采用Quantity One图像分析软件进行灰度比分析。

1.11小鼠皮肤和肾脏组织病理学变化检测

取上述小鼠皮肤及肾脏样本，经过脱水、浸蜡、包埋、切片(5 μm)、展片、烤片等程序后，以苏木精-伊红染色，在显微镜下拍照、记录并分析其病理学变化情况。

1.12统计学分析

2 结果

2.1 TLR4 mAb降低HSP小鼠24 h尿蛋白含量

小鼠尿蛋白检测结果(表1)显示，和正常对照组比较，HSP模型组小鼠24 h尿蛋白含量显著升高(P<0.01)；和HSP模型组和同型对照组比较，TLR4 mAb组小鼠24 h尿蛋白含量显著降低(均P<0.01)。

2.2 TLR4 mAb提升HSP小鼠RES功能

小鼠RES功能检测结果(表2)显示，和正常对照组比较，HSP模型组小鼠吞噬指数K及吞噬系数α均显著降低(均P<0.01)，即为小鼠RES功能的下降；和HSP模型组和同型对照组比较，TLR4 mAb组小鼠吞噬指数K及吞噬系数α均显著增加(均P<0.01)，即小鼠RES功能增强。

表1 各组小鼠24 h尿蛋白含量变化Table 1 Changes of 24-h urine protein content of mice

与正常对照组比较，**P<0.01；与HSP模型组比较，##P<0.01；与同型对照组比较，&&P<0.01

2.3 TLR4 mAb促进HSP小鼠外周血单核细胞中Th17/Treg平衡

流式细胞术检测结果(表3)显示，与正常对照组比较，HSP模型组小鼠外周血单核细胞中Th17细胞占比及Th17/Treg比值显著增加(均P<0.01)，而Treg细胞占比显著降低(P<0.01)；与HSP模型组和同型对照组比较，TLR4 mAb组小鼠Th17细胞占比及Th17/Treg比值显著下降(均P<0.01)，而Treg细胞占比显著增加(均P<0.01)。

表2 各组小鼠RES功能变化Table 2 Changes of RES function in mice of each

与正常对照组比较，**P<0.01；与HSP模型组比较，##P<0.01；与同型对照组比较，&&P<0.01

表3 各组小鼠外周血Th17及Treg细胞占比变化Table 3 Changes of proportion of Th17 and Treg cells in peripheral blood of mice in each

与正常对照组比较，**P<0.01；与HSP模型组比较，##P<0.01；与同型对照组比较，&&P<0.01

2.4 TLR4 mAb对HSP小鼠血清S-IgE、IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β分泌的影响

小鼠血清ELISA检测结果(表4)显示，与正常对照组比较，HSP模型组小鼠血清S-IgE、IL-17、IL-6、IL-10及TGF-β分泌水平显著升高(均P<0.01)；与HSP模型组比较，TLR4 mAb组的S-IgE、IL-17、IL-6显著降低(均P<0.01)，IL-10、TGF-β显著升高(均P<0.01)。

表4 各组小鼠血清S-IgE及免疫细胞因子水平变化Table 4 Changes of serum S-IgE and immune cytokine levels in mice of each

与正常对照组比较，**P<0.01；与HSP模型组比较，##P<0.01；与同型对照组比较，&&P<0.01

2.5 TLR4 mAb抑制HSP小鼠RORγt、促进Foxp3基因的表达

qRT-PCR检测结果(图1)显示，与对照组比较，HSP模型组小鼠皮肤和肾脏组织中RORγt的mRNA水平显著升高(均P<0.01)，而Foxp3的mRNA水平显著降低(均P<0.01)；与HSP模型组及同型对照组比较，TLR4 mAb组小鼠皮肤和肾脏组织中RORγt的mRNA水平显著降低(均P<0.01)，而Foxp3的mRNA水平显著升高(均P<0.01)。

A：RORγt基因的表达水平；B：Foxp3基因的表达水平；与正常对照组比较，**P<0.01；与HSP模型组比较，##P<0.01；与同型对照组比较，&&P<0.01图1 各组小鼠皮肤和肾脏组织中RORγt及Foxp3基因的表达Fig.1 Expression of RORγt and Foxp3 genes in skin and kidney tissues of mice in each group

2.6 TLR4 mAb抑制HSP小鼠TLR4及IL-17蛋白的表达

如图2，与正常对照组比较，HSP模型组小鼠皮肤及肾脏组织中TLR4、IL-17蛋白水平升高；与HSP模型组比较，TLR4 mAb组的TLR4、IL-17蛋白表达降低。

2.7 TLR4 mAb改善HSP小鼠组织病理学变化

苏木精-伊红染色结果(图3)显示，正常对照组小鼠皮肤及肾脏组织表现正常，无病变出现。而HSP模型组和同型对照组则出现皮肤水肿，明显的血管扩张、充血甚至出血，可见较多炎症细胞浸润，同时，肾小球囊腔有积液，且肾小球系膜出现增生，也有炎症细胞浸润。和HSP模型组比较，TLR4 mAb组和西咪替丁组的以上病理症状均有减轻。

1：正常对照组；2：HSP模型组；3：同型对照组；4：TLR4 mAb组；5：西咪替丁组；A：皮肤组织；B：肾脏组织图2 各组小鼠皮肤及肾脏组织TLR4及IL-17蛋白表达Fig.2 Expression of TLR4 and IL-17 protein in skin and kidney tissue of mice in each group

A/F：正常对照组；B/G：HSP模型组；C/H：同型对照组；D/I：TLR4 mAb组；E/J：西咪替丁组图3 小鼠皮肤及肾脏组织病理学变化(苏木精-伊红染色，×200)Fig.3 Histopathological changes of skin and kidney in mice(Hematoxylin-eosin staining，×200)

3 讨论

HSP是由多种原因导致的血管性疾病，多发于儿童，严重阻碍患者的发育并降低其生活质量[12]。Toll样受体是一类细胞表面跨膜受体，能够有效识别病原相关分子，可以介导宿主细胞内的多种信号通路，Toll样受体是机体发生感染，启动免疫反应和炎症反应的第一道防线，同时也是固有免疫和适应性免疫的桥梁[13]。大量研究已证明，TLR4可以通过介导细胞因子的合成，促进T细胞的活化，以及介导Th1/Th2平衡等途径调节HSP的发病[14]。但在HSP患儿体内高水平的TLR4是否还通过其他免疫途径介导HSP还不清楚。因此本研究采用TLR4 mAb对HSP小鼠模型进行干预，探究TLR4 mAb对HSP小鼠损伤的保护作用及机制。

HSP为一种由免疫球蛋白A(IgA)为主的系统性血管炎症，主要症状为血管壁变得更脆，且通透性增强[15]。本研究采用印度墨水封闭小鼠RES，另外持续以抗原刺激免疫系统，建立了HSP小鼠模型。14周造模结束后，与对照组比较，模型组小鼠尿蛋白含量显著升高，提示持续的抗原刺激导致小鼠产生典型的皮肤性病变，引发HSP肾炎，肾脏组织的病理染色结果也表明其可导致HSP肾炎的发生。刘建宏等[16]所构建的HSP小鼠模型也表现出RES功能的下降和血清免疫循环复合物(CIC)水平的增加。前期对HSP机制的研究主要集中于IgA和IgG等抗原抗体复合物，但近几年研究证实IgE介导的Ⅰ型速发型变态反应也参与了HSP的发生和发展[17]。在本研究中，HSP小鼠模型经TLR4 mAb的干预治疗后，显著提升了RES功能，而S-IgE水平显著下降，我们认为TLR4 mAb可以显著改善HSP小鼠的过敏性症状。

目前，细胞免疫失衡被普遍认为与HSP的发病机制相关[18]。Th17和Treg是近些年发现的CD4+T细胞亚群，它们在维持机体免疫平衡过程中发挥着重要作用，且免疫相关性疾病和感染性疾病中广泛存在着Th17/Treg细胞失衡，主要表现在CD4+IL-17+Th17细胞的增多及CD4+CD25+Treg细胞的减少[19]。其中，在HSP中同样发现Th17细胞及相关因子IL-6、IL-17以及RORγt表达明显增高，而Treg及Foxp3的表达显著降低[20]。周杜鹃等[21]在HSP的相关性研究中发现HSP肾炎患儿体内存在Th17细胞及其相关因子IL-17水平的明显增高，而Treg水平的明显降低，提示Th17/Treg免疫失衡参与了HSP肾炎的发病过程；且HSP组与HSP肾炎组患儿Th17/Treg比值无显著差异，进一步提示了长期的HSP临床症状无论是否累及肾脏诱发HSP肾炎，其二者在发病机制上无本质性区别，均与Th17/Treg免疫失衡密切相关。而本研究显示，HSP小鼠存在典型的Th17/Treg细胞比例失调及相关调控因子RORγt、Foxp3的差异性表达；此外，由此导致的一系列炎症因子出现明显的上调，进而诱发皮肤及肾脏炎症反应。而TLR4 mAb的干预治疗能改善HSP小鼠皮肤及累及至肾脏的炎症反应。

综上所述，TLR4 mAb能显著提升HSP小鼠的RES功能，降低血清过敏反应标志物S-IgE的分泌水平，改善皮肤及肾脏组织的组织病理学变化。其作用机制可能与TLR4 mAb直接或间接降低TLR4、IL-17的表达水平进而介导Th17/Treg免疫平衡密切相关。而本研究仅从动物水平验证及阐述了TLR4 mAb治疗HSP小鼠的有效性及潜在机制，其对临床患者的作用效果如何仍需进一步深入研究。