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缺氧缺血致脑室周围白质软化新生大鼠连接蛋白47表达及其对少突胶质细胞髓鞘化的影响

2020-05-20侯阿娜曲双双富建华

中国医科大学学报 2020年4期
关键词:髓鞘白质免疫组化

侯阿娜,曲双双,富建华

(1.中国医科大学附属盛京医院儿科,沈阳 110004;2.北部战区总医院儿科,沈阳 110016)

近年来,极低和超低出生体质量婴儿的存活率明显提高,但随之而来的脑室周围白质软化(periventricular leukomalacia,PVL)发病率居高不下[1]。PVL作为早产儿脑白质损伤的最严重形式,已成为影响低出生体质量婴儿日后生存质量的主要疾病。我国研究[2]结果显示早产儿PVL发生率为8%~26%,在极低出生体质量婴儿中PVL发生率为5%~17%,其中74.2%以上发生脑瘫。PVL的病因较为复杂,目前研究[3-6]认为与缺氧缺血(hypoxia ischemia,HI)、全身感染和炎症反应、小胶质细胞活化、兴奋性毒性、自由基损害以及大脑白质少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs)自身的发育易损性等有关。而HI始终被认为是其发病的主要原因,其病理学基础为OLs弥漫性损伤伴髓鞘形成障碍[7-8]。

连接蛋白47(connexin 47,Cx47)是缝隙连接蛋白家族的一员,可通过缝隙连接通道直接介导细胞间缝隙连接通道(gap junctional intercellular communication,GJIC),参与并影响细胞死亡过程[9]。Cx47被证实可形成Cx47/Cx47和Cx47/Cx43等功能性缝隙连接,促使细胞间营养物质、离子、第二信使及小分子(约1×103)等通过,在中枢神经系统髓鞘的形成和损伤修复中起到关键的作用[10]。Cx47缺乏可引起遗传性脱髓鞘疾病[11-13]。PARENTI等[12]通过实验证实Cx47广泛存在于OLs和髓鞘当中,既在髓鞘形成早期的发展过程中,也参与新髓鞘的形成,且在脱髓鞘后髓鞘再生的恢复阶段表达被上调。由于PVL的晚期病理结局主要为OLs弥漫性损伤伴髓鞘形成障碍,Cx47是否参与此阶段的髓鞘损伤及修复,目前尚不清楚。因此,本研究在建立HI致PVL模型的基础上,动态监测Cx47的表达变化,旨在阐明Cx47是否与PVL髓鞘的损伤及修复相关。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型制备

健康清洁级3日龄SD大鼠120只(中国医科大学附属盛京医院实验中心提供),随机均分为HI组(n=60)、对照组(n=60),雌雄不限。按本课题组以往PVL动物模型建立方法[14],将3日龄SD大鼠吸入性乙醚麻醉,仰卧位显微镜下固定,碘伏消毒后,在颈部紧贴气管右侧切纵形切口(0.5~1.0 cm),分离并用7/0一次性缝合线结扎右侧颈总动脉,在结扎的两端之间将动脉剪断,防止结扎线脱落缺血不彻底,缝合切口,表皮用生理盐水清洗干净(手术时间<5 min),术后将新生鼠放入恒温低氧箱2 h(92%氮气和8%氧气混合气体);然后返回母鼠身边饲养。对照组仅分离右侧颈总动脉,不结扎也不暴露于低氧中。

1.2 标本采集及制备

2组分别于术后1、3、7、14 d处死大鼠,每个时间分别处死15只。乙醚吸入麻醉后,0.9%生理盐水左心室灌注,4% 多聚甲醛溶液固定,断头取脑,以视交叉为中心前后2 mm取脑组织。分别用于 HE染色、透射电镜分析、免疫组化和免疫荧光观察、Western blotting和实时PCR检测。

1.3 实验方法

1.3.1 HE染色观察脑组织形态:取各时间点脑组织后,4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、浸蜡、包埋,连续冠状切片,片厚4.5 μm。二甲苯、乙醇梯度脱蜡后进行HE染色,每组各时间点随机抽取6张,每张切片光镜下(×400)随机选取5个脑室周围脑白质视野观察病理改变。

1.3.2 透射电镜观察OLs间缝隙连接超微结构:对照组及HI组大鼠各2只,10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 mL/kg)后迅速断头取脑,选取脑组织右侧白质(1 mm3),置于 2.5%戊二醛 4 ℃保存。1%锇酸 4 ℃下固定24 h后,用 30%~100%浓度丙酮梯度脱水,环氧树脂包埋,超薄切片机切片(片厚约50 μm)。切片用醋酸双氧铀及硝酸铅双重染色后,在JEM-1200Ex透射电镜(日本Hitachi Electronic公司)下识别具有特殊超微结构特征的OLs及其缝隙连接,观察OLs间缝隙连接状态的超微结构。

1.3.3 免疫组化检测Cx47、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)表达及定位:脑组织石蜡切片常规脱蜡后,3%过氧化氢溶液室温处理20 min;标准柠檬酸缓冲液进行微波修复;山羊血清室温封闭30 min;滴加一抗(Cx47 1 ∶200,兔抗大鼠抗体购自美国Santa Cruz公司;MBP 1 ∶300稀释,兔抗大鼠抗体购自美国Abcam公司)4 ℃过夜;阴性对照以PBS替代一抗。0.01 mol/L PBS洗涤,滴加生物素标记的羊抗兔IgG(免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司),37 ℃30 min;辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素37 ℃30 min;DAB显色(北京中杉金桥生物技术公司),苏木精复染,乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。利用美国 Universal Imaging Porporation图像分析系统,应用MetaMorph软件,测定平均光强度以表示阳性产物的强度。同时采用连续切片方法双标Cx47及MBP,进而实现Cx47及MBP的共定位。

1.3.4 Western blotting测定Cx47、MBP蛋白表达水平:按照文献[15]方法,取右侧脑组织50~80 mg,提取蛋白,并采用BCA法测定蛋白浓度。加入细胞裂解液及缓冲液,加热变性。各标本蛋白(20 μL)上样,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS -PAGE),转印,Tris盐酸缓冲液(TBST)漂洗,脱脂奶粉封闭2 h,TBST清洗3次,每次10 min,加一抗Cx47(1 ∶800)、MBP(1 ∶1 000),4 ℃过夜,阴性对照加TBST代替一抗。TBST洗3次,每次10 min,二抗(山羊抗兔1 ∶2 000;山羊抗小鼠 1:2 000购自北京中山金桥生物技术有限公司)工作浓度1 ∶2 000室温孵育2 h,TBST洗 膜3次,每 次10 min,GAPDH做内参各组进行对比。最后进行化学发光(ECL kit;Santa Cruz Biotechnology)显色。结果用凝胶图像分析系统(Chemi Imager 5500 V2.03软件)进行吸光度扫描分析,并用图像分析系统(Fluor Chen 2.0软件)对扫描图像进行分析。脑组织内的蛋白用平均灰度值表示,蛋白灰度值越高表示蛋白含量越高。

1.3.5 实时PCR方法测定Cx47、MBP基因表达:应用Trizol-丙酮沉淀法提取RNA,按TaKaRa反转录试剂盒说明反转录合成cDNA[15]。引物由上海生工公司设计并合成,见表1。采用TaKaRa实时-染料法(20 μL体系)进行定量PCR扩增。Cx47mRNA的相对表达量应用2-ΔΔCt法进行计算。

1.4 统计学分析

表1 实时PCR测定基因表达引物列表Tab.1 RT-PCR primer sequences

2 结果

2.1 一般状态及行为改变

对照组大鼠一般状态反应良好,吃奶好,肤色红润,生长发育迅速。而HI组逐渐出现状态反应差、周身循环不良、皮肤发绀、苍白等表现,随着低氧时间延长皮肤苍白逐渐加重,继而出现烦躁不安,激惹,有时可见四肢抽搐,最终出现嗜睡、大小便失禁等表现,恢复喂养后症状缓解。但随生长发育时间的延长,HI组出现明显活动减少、运动不协调、睁眼障碍及生长发育延迟等表现。

2.2 形态学变化

光镜下,对照组脑组织形态结构正常,细胞分布均匀、排列紧密有序,细胞结构完整,核圆形、淡染,染色清晰,随着大鼠日龄的增加细胞逐渐成熟变大,细胞形态更加完整清晰(图1A、1B、1C、1D)。HI组1 d脑白质内胶质细胞间隙增宽,细胞变形,排列紊乱,少量细胞出现核固缩(图1E),手术后3 d胶质细胞大量坏死,并伴有脑白质广泛结构疏松、紊乱,可呈筛网状坏死,形成空洞等(图1F)。与手术后 3 d比较,手术后7、14 d溶解坏死细胞逐渐修复,脑白质病变及坏死区域明显减轻,筛网状损伤基本消失,取而代之的是条索状、点状及囊性坏死,最终形成软化灶(图1G、1H)。

2.3 脑组织缝隙连接超微结构变化

对照组可见到OLs形态结构完整,细胞膜及核膜明显,胞核大而清晰,核内染色质丰富且分布均匀。OLs通过致密的缝隙连接直接相连(图2A)。与对照组比较,HI组OLs形态极其不规则,结构明显异常,随损伤加重大量细胞溶解坏死,细胞核结构甚至消失,核染色质浓缩、异染,细胞间缝隙连接断裂不连续(图2B)。

2.4 免疫组化检测脑组织内蛋白的表达

图1 各组脑组织形态学改变 HE× 400Fig.1 Morphological changes in brain tissue in each group HE× 400

图2 透射电镜下观察HI对少突胶质细胞间缝隙连接通道的影响× 8 000Fig.2 The effect of HI on oligodendrocyte gap junctions observed under a transmission electron microscope × 8 000

2.4.1 免疫组化检测脑组织内Cx47的表达:对照组手术后1 d Cx47在脑组织中即有表达,并随日龄增加染色呈大量棕黄色(图3A、3B、3C、3D),随着日龄增加Cx47表达量也增加;HI组手术后1、3、7、14 d脑组织中Cx47表达虽呈上升趋势,但相同时间点的表达均较对照组明显减少。手术后3、7 d Cx47的表达减少尤为明显(图3F、3G);而在14 d 2组Cx47表达差异开始缩小(图3H)。

图3 免疫组化检测脑组织内Cx47的表达× 200Fig.3 Immunohistochemical analysis of Cx47 expression in brain tissue × 200

2.4.2 免疫组化MBP的定位及表达:对照组及HI组手术后1 d脑室周围白质MBP阳性细胞表达较少,随着日龄的增加其表达升高。14 d时MBP广泛表达于OLs胞质及轴突突起上,半定量结果显示HI组MBP的表达较对照组降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。对照组手术后1、14 d脑组织MBP表达随着日龄增加而增加,由1 d的胞质表达到14 d的广泛细胞间隙突起的表达。HI组MBP的表达趋势与对照组相同,但相同时间点较对照组表达降低,HI组细胞突起明显减少。见图4。

2.5 新生大鼠脑组织中Cx47蛋白表达(表2、图5)

通过Western blotting检测脑组织中Cx47的蛋白表达水平,发现Cx47蛋白表达在对照组及HI组均随着日龄的增长逐步增加(P< 0.01)。但2组间比较,HI组手术后3、7、14 dCx47蛋白水平较对照组明显减少(P< 0.01)。

图4 免疫组化定位MBP的表达× 200Fig.4 Immunohistochemical detection of MBP expression × 200

表2 2组Cx47蛋白和mRNA表达水平比较Tab.2 The expression levels of Cx47 protein and mRNA in the two groups

图5 各组手术后脑组织Cx47蛋白表达Fig.5 Expression of Cx47 protein in brain tissue after surgery

2.6 脑组织Cx47基因表达水平

实时PCR检测脑组织Cx47mRNA表达水平,发现对照组和HI组在术后第1天即出现Cx47mRNA表达,并随着日龄增加Cx47mRNA水平逐渐增加(P<0.01)。对照组Cx47mRNA出现高表达先快后慢,直到术后14 d达到高峰(P< 0.01)。2组间比较,HI组Cx47mRNA的表达水平在1、3、7、14 d均较对照组明显降低(均P< 0.01)。见表2。

3 讨论

OLs的主要功能是包绕轴突、形成绝缘的髓鞘结构、协助神经电信号的跳跃式高效传递,维持和保护神经元的正常功能。而PVL的主要病理改变就是OLs的弥漫性损伤伴髓鞘形成障碍[12],OLs对HI高度敏感,HI时未成熟OLs易受到氧化应激等损伤,导致其坏死以及成熟分化障碍。损伤后的OLs不能包裹轴突形成髓鞘,进而导致PVL的发生[7,17]。

缝隙连接可以直接连接相互耦联细胞的胞质,参与细胞间物质、能量交换和信息传递[12,18]。近几年来CJIC作为新兴的膜蛋白通道被广泛关注,在脊椎动物中几乎所有分化细胞都是通过缝隙连接来交流的,包括血红细胞、精子、成人骨骼肌、心肌、平滑肌细胞、胃肠道上皮细胞、脑神经细胞等[19]。中枢神经系统的多种疾病(脱髓鞘疾病、癫痫、胶质瘤、脑缺血缺氧性损伤等)均证实与GJIC有关[20]。缝隙连接蛋白是由多基因家族编码的一大类膜蛋白,在哺乳动物中发现有15种。其中Cx47表达于少突胶质细胞的髓鞘,Cx47基因突变会引起MBP的表达降低,从而导致脑白质异常损伤的脱髓鞘疾病[13,21]。

本研究结果表明,新生大鼠受到HI损伤后会出现行为、运动、发育等方面的异常表现。大脑组织病理显示随着损伤的加重脑组织出现细胞凋亡坏死,脑组织筛网状及空洞形成,进而形成软化。在透射电镜下看到正常脑组织OLs间缝隙连接呈现连续致密的连接,细胞间通道关闭状态,而受到HI损伤后OLs间呈间断不连续的缝隙连接。与对照组比较,HI组脑组织中Cx47表达从术后1 d开始较对照组减少,2组间差异随HI时间延长而更加明显。同时免疫组化检测发现HI组脑组织中MDP表达也较对照组减少。Cx47广泛存在于OLs和髓鞘中,在髓鞘形成早期的发展过程中参与新髓鞘的形成[12],HI后脑组织中Cx47表达下降与OLs及髓鞘损伤一致,甚至比髓鞘损伤出现更早,这表明在HI致新生大鼠PVL中Cx47的表达下调可能引起OLs的损伤及髓鞘化障碍,从而导致髓鞘的发育延迟。

综上所述,HI条件下新生大鼠髓鞘发育成熟障碍,OLs间缝隙连接开放,脑组织中Cx47表达减少,提示Cx47可能对GJIC功能起到调控作用,并影响髓鞘发育。其具体作用机制有待进一步探索,并可能成为PVL治疗的新靶点。

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