ETV4在胃肠道间质瘤中的表达及其临床意义

徐丹，邱雪杉，2

（中国医科大学 1.附属第一医院病理科，沈阳 110001；2.基础医学院病理学教研室，沈阳 110122）

胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤［1］，可发生C-KIT和血小板衍生生长因子受体α（platelet-derived growth factor receptors-α，PDGFR-α）基因突变［2］。大约10%～30%的GIST发生转移，是具有恶性潜能的肿瘤［3］。准确判断GIST生物学行为是治疗的关键。迄今为止，尚没有公认的生物学指标来判断其生物学行为。

ETV4是多瘤促活化因子3（polyoma enhancer activator 3，PEA3）家族成员之一，在细胞的生长、侵袭以及转移中发挥着重要的作用［4-5］。因此，本研究旨在探讨ETV4转录因子在GIST的表达及其与临床病理特征的关系，以及ETV4与C-KIT、PDGFR-α基因突变的关系。

1 材料与方法

1.1 标本

收集2012年至2018年2月中国医科大学附属第一医院病理科确诊为GIST的石蜡标本，共91例为实验组。同时随机选取10例实验组的癌旁正常胃肠道组织设为对照组。纳入标准：病理及免疫组化确诊，免疫组化项目包含Ki67；危险度分级明确；完整的临床病历资料；组织蜡块材料充足。排除标准：病理或免疫组化无法确诊；危险度分级不明确；不具有完整的临床病历资料；组织蜡块材料较少。

1.2 试剂及仪器

兔抗人多克隆抗体ETV4（HPA005768）购自美国Sigma公司。兔SP检测试剂盒（KIT-9710），PBS缓冲液以及DAB显色液均购于福州迈新生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化：采用免疫组化SP法，测定ETV4在GIST组织中的表达情况。标本石蜡块切片4 μm厚，在75 ℃恒温箱中放置4 h，取出后自然冷却。将切片脱蜡、水合，放置于高压水浴锅内的枸橼酸钠缓冲液中进行热修复，滴加内源性过氧化物酶阻断剂，37 ℃静置30 min后，PBS缓冲液洗片3次，一次5 min，随后滴加山羊血清封闭液，37 ℃静置40 min后，滴加ETV4抗体（1 ∶200）切片在4 ℃过夜。复温、PBS缓冲液洗片后滴加生物素标记的第二抗体，37 ℃静置30 min，PBS缓冲液洗片3次，一次5 min，随后滴加链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶，37 ℃静置30 min后，PBS缓冲液洗片后滴加DAB显色液，自来水冲洗终止显色，苏木素复染，脱水，最后用中性树胶封片。

1.3.2 基因检测：用直接测序法对所有病例进行C-KIT和PDGFR-α测序，测序由厦门艾德生物有限公司完成。

1.4 GIST术后危险度评分标准

2008年4月，美国国立卫生研究院（national institutes of health，NIH）重新发布了关于原发可切除GIST的危险度评分标准。与FLETCHER等［6］提出的相比，增加了原发肿瘤的部位以及肿瘤破裂作为评判危险度的指标。见表1。

1.5 结果判定

由2名病理科医师在400倍的光学显微镜下随机观察5个视野，每个视野至少计数100个完整肿瘤细胞。肿瘤细胞核中出现棕黄色染色为阳性，以阳性细胞比例得分乘以染色强度得分为最终评判得分。阳性细胞比例评分：＜5%为0分，5%～＜25%为1分，25%～＜50%为2分，50%～＜75%为3分，≥75%为4分。染色强度评分：未染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。在统计学分析中，最终得分≤4分为弱阳性（+），5～8分为中等阳性（++），≥9分为强阳性（+++）。

表1 原发GIST切除后风险分级Tab.1 Proposed modification of the consensus classification for selecting patients with GISTs for adjuvant therapy

1.6 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。计数资料应用行×列联表的χ2检验或Fisher确切概率法；相关性分析应用Spearman相关分析。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GIST中ETV4的表达情况

在91例GIST组织中，有18例（19.8%）ETV4呈弱阳性表达，34例（37.4%）ETV4呈中等阳性表达，39例（42.9%）呈强阳性表达。见图1。ETV4在癌旁正常组织中呈弱阳性表达。

2.2 ETV4在GIST中的表达与临床病理特征的关系

图1 ETV4在GIST中的表达 免疫组化SP法 ×400Fig.1 ETV4 expression in a gastrointestinal stromal tumor SP ×400

ETV4转录因子在GIST中的表达水平与患者的性别，年龄，发生部位，组织学类型无关（P＞ 0.05），而与肿瘤大小、核分裂像、Ki-67增殖指数有关（P＜0.05）。GIST最常见的转移部位是肝脏，在本研究中共有8例发生肝脏转移，其中6例在最初诊断时已有肝转移，ETV4转录因子表达水平与肝转移有关（P＜0.05），ETV4表达水平越高，患者发生转移的可能也越大。见表2。此外，采用Spearman相关分析结果显示，ETV4转录因子表达水平越高，其危险度越高，并且两者具有显著正相关（r=0.387，P＜ 0.001）。见表3。

2.3 ETV4在突变型和野生型GIST的表达的相关性

在91例GIST组织中，11例发生PDGFR-α基因突变，65例发生C-KIT基因突变，其中60例发生外显子11突变，4例发生外显子9突变，1例发生外显子13突变，野生型18例，Spearman相关分析发现ETV4转录因子表达水平与C-KIT基因突变呈显著正相关（r=0.324，P=0.008），差异有统计学意义。此外，ETV4转录因子表达水平与突变型GIST也呈显著正相关（r=0.325，P=0.005），然而ETV4蛋白表达水平与PDGFR-α基因突变无关（P＞ 0.05）。见表3。

3 讨论

GIST多见于50岁以上的老年人［1］，最常发生于胃部（60%～70%），其次为小肠（25%～36%），结直肠（5%）以及食管（5%）［7］。显微镜下大多数GIST由梭形细胞组成（70%），少数由上皮样细胞（20%）或混合细胞型（10%）构成。GIST为具有恶性潜能的肿瘤，大约10%～30%的GIST发生转移等恶性生物学行为［3］，最常见的转移部位为肝脏（65%），其次为腹膜（21%），也可转移至骨和肺（10%），但极为罕见［8］。因此准确判断其生物学行为是治疗GIST的关键。

ETS家族是最大的转录调控因子家族之一，其亚家族PEA3家族主要参与多种生理过程，如早期发育，器官发生和形态发生［9］。在胚胎形成时期，ETV4广泛表达于各个组织，促进肾脏、肺、乳腺等上皮源性器官的形态发生［4］，然而ETV4很少表达于成人的正常组织中，主要表达于乳腺癌，胃癌，前列腺癌，结肠癌和卵巢癌等肿瘤组织［10］。大量研究［10-14］表明，ETV4在前列腺、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、胆管癌的高度表达往往提示预后不良。在本研究中，ETV4在GIST中呈中强度阳性率为80.2%，并且与肿瘤大小，核分裂像，Ki67增殖指数，肝转移有关。因此，ETV4的异常表达与GIST细胞的增殖，转移等生物学行为有关。这与ZENG等［15］的研究结果一致。此外，本研究还发现ETV4转录因子在GIST的表达水平与肿瘤的危险度呈显著相关，ETV4转录因子表达水平越高，危险度越高。因此ETV4转录因子可与危险度一起作为临床判定GIST生物学行为的重要指标。

表2 GIST患者ETV4在不同病理特征中的表达Tab.2 ETV4 expression levels in the patients with different clinicopathological features of gastrointestinal stromal tumors

表3 ETV4在GIST的表达与危险度、基因突变的相关性Tab.3 Correlation of ETV4 expression in gastrointestinal stromal tumor to risk rank and gene mutation

此外，本研究还探讨ETV4转录因子的表达与野生型，突变型GIST的关系。C-KIT以及PDGFR-α基因突变是人类患有GIST的主要原因。70%～80%的GIST有C-KIT突变，最常见的是外显子11突变，而5%～10%GIST存在PDGFR-α突变［16］。对于既没有C-KIT基因突变，也没有PDGFR-α基因突变的GIST为野生型GIST［17］。在本研究中，突变型GIST中ETV4呈中强度阳性率为86.3%，并且ETV4转录因子的表达水平与突变型GIST显著相关，发生C-KIT基因突变的GIST中ETV4呈中强度阳性率为86.2%，并且ETV4转录因子的表达水平与C-KIT基因突变具有显著相关，然而ETV4转录因子的表达水平与PDGFR-α基因突变无关。因此，ETV4转录因子的表达水平与C-KIT基因有关。RAN等［18］研究报道PEA3家族另一成员ETS变异体1通过结合KIT增强子区域从而正调节KIT的表达水平，促进肿瘤的发生发展。大量研究［11，19-20］表明，PEA3家族具有很高的序列同源性以及相似的高度保守的DNA结合结构域，然而调节C-KIT表达的是否是这组同源序列或者DNA结合结构域目前尚不清楚，仍需要进一步的研究。

综上所述，GIST的生物学行为除了依靠肿瘤大小，核分裂像来判断外，ETV4转录因子的表达也可以作为生物学指标，以便综合性地判断GIST的生物学行为，更有助于指导治疗。此外，ETV4转录因子的表达水平，还与C-KIT突变型GIST显著相关，为GIST的治疗提供新的方向和思路。