P16和Ki-67在宫颈低级别鳞状上皮内病变中的表达及与预后的关系

马新义 ，许 励，王桂花

(1.杭州迪安医学检验中心 病理实验室, 浙江 杭州 310030; 2. 杭州师范大学附属医院 病理科, 浙江 杭州 310015)

2018年全球约有57万新发宫颈癌病例和31.1万死亡宫颈癌病例，其发病率和死亡率均居所有女性恶性肿瘤的第4位[1]。我国每年的宫颈癌新发病例占世界总新发病例的20%～30%，且以每年2%～3%的速度递增，并呈年轻化的趋势[2]。WHO女性生殖系统分类将宫颈癌前病变命名为宫颈上皮内瘤变，并分为低级别鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial leisons/cervical intraepithelial neoplasm grade 1, LSIL/CIN1)和高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL)。根据美国国家综合癌症网络(NCCN)宫颈癌筛查指南，LSIL的治疗以临床观察为主，密切随访，HSIL需要宫颈局部治疗。但LSIL中隐含着HSIL的风险，寻找有效的早期预测因子对提示LSIL的转归和对初次确诊为LSIL的患者进行分流干预具有积极意义。本研究探讨P16和Ki-67在LSIL/CIN1中的表达情况及与预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2016年8月—2018年10月因可疑宫颈病变在杭州迪安医学检验中心行阴道镜下宫颈活检，经组织学病理诊断为宫颈LSIL/CIN1的84例患者为研究对象。所选LSIL/CIN1患者年龄27～69岁，平均(44.7±9.1)岁。另选取同期经组织学病理诊断为非肿瘤性正常宫颈组织22例，年龄22～65岁，平均(43.0±5.7)岁。本研究经杭州迪安医学检验中心伦理委员会批准。

1.2 检测方法 组织标本经中性甲醛固定、常规石蜡包埋、4 μm连续切片后经二甲苯脱蜡，梯度酒精至水，常规苏木素-伊红(hematoxylon-eosin，HE)染色，免疫组化实验操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。采用Ventana 全自动免疫组化染色仪(瑞士罗氏公司)检测P16的表达情况，采用EnVision二步法进行免疫组化检测Ki-67的表达情况， Ki-67单克隆抗体(克隆号：7B11)购于北京中杉金桥生物有限公司；P16单克隆抗体(克隆号：E6H4)购于上海罗氏有限公司。P16阳性定位于细胞核或细胞浆内，胞浆及细胞核出现棕黄色颗粒判读为阳性细胞，散在或者无棕色颗粒染色判读为阴性细胞[3]。Ki-67阳性定位于细胞核，以细胞核出现棕黄色或棕色颗粒判定为阳性细胞。阳性细胞表达率：阳性细胞率0%～<5%为阴性(-)，5%～<25 %为弱阳性(+)，25 %～<50 %为阳性(++)，≥50 %为强阳性(+++)。免疫组化结果由2位资深妇科专科病理医师采用双盲法阅片判读。

1.3 预后判读 每位随访病例均经巴氏涂片检查、阴道镜活检和HR-HPV检测。疾病进展：组织学诊断结果为HSIL/CIN2及以上级别病变；消退：标本组织学诊断结果为阴性；病变持续：宫颈活检或宫颈细胞学结果为LSIL/CIN1[4]。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件，计数资料采用Fisher精确检验或卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P16和Ki-67的表达情况 LSIL/CIN1病例标本中P16阳性表达率为28.6%(24/84)，正常/炎症病例中P16未见表达，差异具有统计学意义(χ2=46.124，P<0.001)。Ki-67在LSIL/CIN1病例标本中的阳性表达率(52.4%，44/84)高于在宫颈正常/炎症组中的阳性表达率(22.7%，5/22)，差异具有统计学意义(χ2=8.792，P=0.003)。LSIL/CIN1组Ki-67阳性细胞表达率(5%～<25%)的比例为42.9%(36/84), 阳性细胞表达率(25%～<50%)的比例为9.5%(8/84)；宫颈正常/炎症组Ki-67阳性细胞表达率(5%～<25%)的比例为22.7%(5/22)，未见阳性细胞表达率(25%～<50%)的病例。见封三图1、图2。

2.2 P16和Ki-67表达与LSIL/CIN1预后的关系 随访12个月，复查结果显示，84例LSIL/CIN1病例中有47例病变消退，24例持续，13例进展。LSIL/CIN1进展组病例中P16阳性表达率(76.9%，10/13)高于持续组(25.0%，6/24)和消退组(19.1%，9/47)，差异均具有统计学意义(P<0.05)；LSIL/CIN1进展组Ki-67阳性表达率(100.0%，13/13)高于持续组(54.2%，13/24)和消退组(38.3%，18/47)，差异均有统计学意义(P<0.05)。Ki-67阳性细胞表达率(25%～<50%)的病例中，进展组比例(38.5%，5/13)高于持续组(8.3%，2/24)和消退组(2.1%，1/47)，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 P16和Ki-67表达与LSIL/CIN1预后的关系

3 讨论

HPV感染尤其是HR-HPV持续感染是诱发宫颈鳞状上皮内病变及宫颈癌的主要危险因素和必要条件之一[5-7]。P16是高危型HPV感染存在的标志[8]，也是HPV具有转录活性即具有真正致瘤作用的标志。P16阻止细胞从G1期到S期，负性调控细胞增殖及分裂，具有抑癌作用[9]。人感染高危型HPV后，高危型HPV DNA整合进入宿主细胞基因组导致E6和E7病毒基因表达，E6降解P53，E7结合pRb并使其失活，致使pRb丧失对p16基因的负反馈抑制作用，导致P16蛋白呈现过表达[10]。有文献报道[11]，98%以上的高危型HPV感染显示P16呈弥漫阳性，P16甚至可以作为高危型HPV检测的代替物，其敏感性和特异性达80%。在低级别宫颈上皮内瘤变中，P16染色阴性存在较高的倒退倾向，染色阳性的更倾向于发展至高级别病变[12]，P16不仅在宫颈上皮内瘤变的分级诊断中具有重要临床意义，还在宫颈癌前病变进展的风险评估中具有应用价值。本研究结果显示，LSIL/CIN1病例标本中P16阳性表达率明显高于正常/炎症病例中的表达，这与Zhang等[13]的报道结果相一致，提示P16在良性或反应性改变与高危型HPV感染相关的宫颈前驱病变之间的鉴别诊断中具有一定意义，P16阳性支持其为HPV感染性鳞状上皮内病变，但是阴性并不能排除LSIL。刘苗[14]的研究显示，P16的表达率会随着宫颈鳞状病变级别升高而呈上升趋势，在正常细胞周期中P16不表达；但当细胞周期调控机制受损时，P16增殖活跃；随着宫颈病变级别的增高，P16呈现高表达。本研究病例随访结果显示，LSIL/CIN1进展组病例中P16阳性表达率明显高于维持组和消退组；提示P16在预测CIN1病人预后进展中具有一定应用价值。但Herfs等[15]报道指出，P16在非鳞状上皮内病变中可能出现假阳性，单独应用P16标记尚不能作为宫颈上皮内瘤病变的诊断依据，需联合其他标记物才可以进行确定诊断。

细胞分裂、增殖的异常活跃是肿瘤恶变的重要环节。Ki-67是一种重要的反映肿瘤增殖活性的蛋白，与增殖细胞核抗原(PCNA)相结合的单抗，标记细胞核及染色体处于G1、S、G2和M期，以此确定肿瘤生长率，Ki-67与肿瘤的增殖、浸润、转移潜能密切相关[16]。近年来，有关Ki-67表达与妇科肿瘤发生、发展及预后的关系成为研究热点。Marko等[17]发现Ki-67在HR-HPV感染的宫颈上皮中高表达，Ki-67的阳性指数随CIN级别的升高逐渐增加。本研究结果显示，Ki-67在LSIL/CIN1病例标本中的阳性表达率明显高于在宫颈正常/炎症病例中的阳性表达率，说明在宫颈低级别CIN组织中存在异常分裂、增殖；LSIL/CIN1进展组Ki-67阳性表达率明显高于持续组和消退组，提示Ki-67的表达阳性可以预测CIN1病人预后进展；Ki-67阳性细胞表达率(25%～<50%)的病例中，进展组阳性表达率明显高于持续组和消退组，说明Ki-67表达越高，进展的风险越高，这与王晓平等[18]的报道结果相似。

综上所述，P16和Ki-67的阳性表达有助于鉴别宫颈低级别鳞状上皮内病变与宫颈炎症性病变和预测宫颈低级别鳞状上皮内病变的预后结果。