过氧化氢诱导小鼠骨髓间充质干细胞衰老细胞模型的建立

徐 飞，郑泽航，徐汉青，杨 卿

(华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，湖北省武汉市430030)

随着中国老龄化社会的进展，衰老相关性研究逐渐成为热点。人体骨骼也会随着年龄的增长而发生衰老，其中骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cell，BMSC)的衰老对骨骼系统的衰老起着至关重要的作用。研究衰老BMSC的特性及生物学功能需要大量的衰老细胞，而衰老细胞的增殖能力较差，无法通过传统的传代培养方法来快速获取足量的细胞。现阶段获取衰老BMSC的方法主要有以下几种：①直接从衰老个体的骨髓中分离提取衰老的间充质干细胞，但高龄小鼠比较难获得，且分离提取的细胞量较少，难以进行细胞扩增；②分离培养正常的BMSC，经过体外培养与传代处理获得自然衰老的BMSC，但此过程时间较长，通常需要多次传代培养[1]；③通过化学与射线照射等方法造成细胞DNA损伤，获得衰老的BMSC模型[2]。

为了建立一种快速、有效且稳定的获得小鼠衰老BMSC的方法，本文根据相关文献及前期预实验[3-5]，采用200 μmol/L过氧化氢(H2O2)处理正常的小鼠BMSC 2 h[5]，处理完毕后，检测相关衰老指标来确认所获得的细胞为衰老的BMSC，以期建立一种快速有效且稳定的衰老BMSC模型。

1 材料和方法

1.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定

取3周龄C57BL/6小鼠(华中科技大学实验动物中心提供)，收集其双侧股骨与胫骨，取髓腔内细胞全骨髓培养法进行培养，获得BMSC，具体分离培养及鉴定方法参考文献[6]。

1.2 H2O2诱导衰老骨髓间充质干细胞模型

取所分离的第3代小鼠BMSC，以1×104个/cm2细胞接种于25 mL培养皿中，培养皿中含5 mL完全培养基[α-MEM(Hyclone公司，美国)，10%胎牛血清(Gibico公司，美国)，1%抗生素]。对照组加入1 μL PBS(Hyclone公司，美国)；造模组加入1 μL H2O2(Sigma公司，美国)，其终浓度为200 μmol/L，两组细胞均处理2 h，处理结束后更换为完全培养基继续培养72 h。

1.3 骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制

将两组细胞以1×104个/cm2接种于96孔板，每孔150 μL，每天同一时间点取出96孔板，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)(Invitrogen公司，美国)，培养4 h后，去上清加入DMSO测定各孔光密度(490 nm)，共测定7天，以此绘制时间光密度BMSC生长曲线。

1.4 SA-β-gal染色

将两组细胞以1×104个/cm2接种于48孔板，细胞完全贴壁后，进行衰老表型β-半乳糖苷酶(senescence associated β-galactosidase，SA-β-gal)染色(Solarbio公司，中国)，衰老的BMSC于镜下呈蓝色。SA-β-gal阳性细胞的计算：每组镜下随机视野计数100个细胞，统计出SA-β-gal阳性细胞个数，并计算百分比。

1.5 端粒功能失调诱导病灶分析

将两组细胞以1×104个/cm2接种于12孔板(Corning公司，美国)，每孔里放置圆形载玻片，让细胞贴于载玻片上生长，细胞贴壁后，进行端粒功能失调诱导病灶(telomere dysfunction-induced foci，TIF)分析。简要操作如下：4%多聚甲醛(Sigma公司，美国)室温固定后，加入1%Triton-X100(Sigma公司，美国)通透细胞；10% BSA(Abcam公司，美国)封闭后加一抗53BP1(Abcam公司，美国)和γH2AX(Abcam公司，美国)双染；荧光二抗(Abcam公司，美国)染色后，DAPI(Invitrogen公司，美国)染核。封片，然后共聚焦显微镜(Cell insight CX5，Thermo Fisher,美国)下观察并拍照。TIF阳性细胞的计算：以53BP1和γH2AX共定位的点代表TIF，每组计数50个细胞，每个细胞存在53BP1和γH2AX共定位的点(显示为黄色点)即认为是TIF阳性细胞，统计两组阳性细胞百分比。

1.6 RNA提取与基因表达分析

将两组细胞分别取1×106个进行RNA提取操作，具体如下：每组细胞加入0.5 mL TRIZOL(Invitrogen公司，美国)进行充分裂解后，加入0.1 mL三氯甲烷，孵育完成后进行离心，细胞RNA位于上清中，吸取上清液，加入等量异丙醇，进行离心操作，RNA位于EP管的底部，吸去上清后以75%乙醇洗涤，并调整两组总RNA至同一浓度。将所提取的RNA反转录为cDNA。Real-time PCR分析两组细胞衰老相关基因p16、p21、p53的表达情况。所用引物序列见表1。

1.7 统计学方法

表1 Real-time PCR引物序列

2 结 果

2.1 两组BMSC生长情况的比较

细胞生长曲线如图1所示，造模组BMSC生长明显较对照组缓慢(P<0.05)。

图1 两组BMSC生长情况的比较a为P<0.05，与对照组比较。

2.2 两组BMSC SA-β-gal阳性细胞的比较

造模组BMSC的SA-β-gal酶活性增强，SA-β-gal阳性细胞(染色呈蓝色)较对照组多(图2A)。造模组SA-β-gal阳性细胞比例明显高于对照组(P<0.05；图2B)。

图2 两组BMSC SA-β-gal阳性细胞的比较A为SA-β-gal染色结果(200×)，蓝色为SA-β-gal阳性细胞；B为SA-β-gal阳性细胞直方图。

2.3 两组BMSC TIF阳性细胞的比较

造模组BMSC TIF阳性细胞较对照组多，差异具有统计学意义(P<0.05；图3)。

图3 两组BMSC TIF阳性细胞的比较A为TIF染色结果(200×)，造模组BMSC存在53BP1/γH2AX共定位点的阳性细胞(白色箭头所示)；B为BMSC TIF阳性细胞直方图。

2.4 两组BMSC p16、p21和p53基因表达的比较

与对照组比较，造模组p16、p21和p53表达均明显增加(P<0.01，P<0.05；图4)。

图4 两组BMSC p16、p21和p53基因表达的比较

3 讨 论

细胞与机体的衰老是生命的基本现象。通过体内或体外的反复细胞分裂，获得衰老细胞的方式耗时耗力且量少。本研究通过H2O2的诱导处理，正常的BMSC发生DNA损伤，导致细胞衰老[7]。衰老的细胞表现出细胞生长缓慢，SA-β-gal染色阳性，端粒功能障碍诱导的损伤灶(TIF)阳性及相关衰老基因p16、p21、p53表达增加。本研究以此得到的衰老细胞模型有效且快速。

H2O2诱导处理正常的BMSC后，细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量聚集，ROS可引发DNA损伤，蛋白质氧化损伤，形成蛋白质交联聚合物等，通过相关细胞通路阻滞细胞周期的进程，诱导细胞衰老，使细胞生长缓慢甚至停滞[8]。

SA-β-gal作为特异性衰老细胞的标志物最早在1995年被Dimir等[9]提出，他们观察到在pH为6.0时，仅有衰老的细胞为β-gal染色阳性，其原因为衰老细胞的内源性溶酶体-半乳糖的过度表达和积累。

端粒的主要功能是保持染色体完整性，可保护DNA免受DNA双链断裂影响。ROS可引起端粒功能障碍，DNA损伤反应。持续的DNA损伤应答，可导致细胞生长停滞，发生细胞衰老。当DNA损伤时，H2AX发生磷酸化，募集DNA修复蛋白进行DNA修复。γH2AX与53BP1等复合体共定位于DNA损伤处进行应答反应，使细胞进入生长停滞，并可能启动衰老程序[10-11]。因此，通过寻找细胞内53BP1和γH2AX共定位的点可以辨别衰老细胞。

氧化应激使得细胞p16、p21、p53基因表达增加。p16、p21、p53在细胞衰老和细胞周期中起关键调控作用[12-13]。p16表达增加可阻止细胞周期通过G1/S检测点使得细胞生长停滞；与此同时，p53的上调可激活p21基因，抑制cyclinA/E-CDK2的活性，阻止细胞周期的进行[14-15]。

刘洋等[3]为建立人胎盘源间充质干细胞的衰老模型，采用H2O2来诱导处理，成功地得到了衰老模型，其H2O2处理浓度和时间与本研究相同。与之不同，郭柏铭等[4]也采用了H2O2诱导大鼠间充质干细胞的方法成功地获得了衰老模型，但其处理方法为500 μmol/L H2O2处理24 h，其可能原因为所处理的细胞不同，郭柏铭等[4]所得到的是衰老的大鼠BMSC，而本研究为小鼠BMSC。

综上所述，通过200 μmol/L H2O2处理小鼠BMSC 2 h，可获得较好的细胞衰老模型，此模型细胞生长慢，SA-β-gal染色阳性率高，TIF阳性细胞多，且p16、p21和p53基因的表达明显增高，可用于衰老BMSC相关实验研究。