牛奶酒酿造过程中微生物多样性的动态变化

（北京农业职业学院食品与生物工程系，北京 102442）

奶酒因营养丰富、保健功效显著而得到人们的关注和认可[1]，然而，奶酒产业的发展受到缺乏成熟发酵剂的制约[2]。目前，奶酒菌株的分离和筛选多采用传统的培养方法，但是这些方法得到的微生物信息比较有限，对微生物多样性及其动态变化的认识存在一定的局限性。最近发展起来的高通量测序技术为分析复杂的微生物体系提供了一种高效便捷的方法，能够获得微生物群落中的全部微生物的遗传信息[3]。因此，本研究拟通过高通量测序技术分析采集到的奶酒发酵醪在奶酒酿制过程中细菌和真菌多样性的动态变化，从而为后续菌种的筛选及最适的菌株配比提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

奶酒发酵醪：收集锡林郭勒盟牧民家中以自然富集菌种发酵风味比较好的新鲜马奶酒发酵醪，用无菌离心管收集后置于冰袋中运回实验室，并置于-20℃冰箱中待测。

三羟甲基氨基甲烷，美国Amresco公司产品；乙二胺四乙酸二钠，北京索莱宝科技有限公司产品；细菌宏基因组DNA提取试剂盒25T/50T，北京福德安科技（北京）有限公司产品；10×PCR buffer、dNTP、rTaq DNA聚合酶、上样缓冲液（6×Loading Buffer），宝生物工程（大连）有限公司产品；溴化乙锭（EB）溶液，天根生化科技（北京）有限公司产品；琼脂糖（Regular Agarose G10），BIOWEST公司产品；引物及2kbp DNA标记物，赛默飞世尔科技公司合成；高通量测序试剂，诺禾致源生物信息技术有限公司产品。

1.2 仪器与设备

超声波清洗器，上海易净超声波仪器有限公司；ZQJ-254型紫外强度计，上海顾村电光仪器厂产品；超净工作台，北京王堂蓝翼科技有限公司；超低温冰箱（MDF-382E），Sanyo公司；小型离心机，Sigma公司；低温高速离心机（Centrifuge 5804R），Eppendon公司；PCR扩增仪（ALD1244），BioRad公司；定量PCR仪（CFX96），BioRad公司；凝胶成像仪（GelDoc-It Imagine System），UVP公司；高通量测序仪（Miseq），Illumina公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品收集

将奶酒发酵醪按1%（w/w）加入到牛奶中发酵0、1、2、3、4、5、6、7、8、9d后，采集发酵样品，分别放入灭菌后的离心管，并转移到-20℃的冰箱中贮藏，用于细菌和真菌多样性的检测。

1.3.2 DNA提取

取2g奶酒样品溶液置于灭菌离心管中，在4℃下13 000r/min离心90min后，按照福德安细菌DNA提取试剂盒的说明提取奶酒样品中的总DNA。

1.3.3 琼脂糖凝胶电泳

取提取的DNA样品4μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，电压为120V，时间为20min。电泳后凝胶在凝胶成像仪拍照。

1.3.4 内参rRNA的混合及PCR

表1 rRNA扩增的引物

为了实现对各个样品rRNA测序数据的相对定量比较，在提取到的奶酒样品的总DNA中加入等体积等浓度的内参rRNA溶液进行PCR。奶酒细菌和真菌扩增的引物如表1所示。

奶酒16S rRNA V3-V4扩增的PCR反应体系如下：ddH2O 11.6μL，5 × FastPfu buffer 4μL；2.5mmol/L dNTPs 2μL；正向引物（5μmol/L）0.8μL；反向引物（5μmol/L）1μL；FastPfu 聚合酶0.4μL；BSA 0.2μL；DNA模板10ng；总体系20μL。奶酒ITS rRNA 1F-2R扩增的PCR反应体系如下：ddH2O 14μL，10×buffer 2μL；2.5mmol/L dNTPs 2μ L；正向引物（5μmol/L）0.8μL；反向引物（5μmol/L） 0.8μL；rTaq 聚合酶0.2μL；BSA 0.2μL；DNA模板10ng；总体系20μL。

PCR反应程序为：95℃预变性3min，27个循环（95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s），72℃延伸10min。取PCR产物3μL进行2%琼脂糖凝胶电泳。奶酒样品的建库和高通量测序均委托北京美吉桑格生物医药科技有限公司完成。

1.3.5 扩增子测序数据生物信息学分析

测序数据处理见操作步骤。将所有样品的全部最终有效数据利用Uparse 软件（Uparse v7.0.1001）[4]进行聚类，默认以97%的一致性将序列聚类成为OTUs（Operational Taxonomic Units），同时选取OTUs的代表性序列，依据其算法原则筛选出在OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。对OTUs代表序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA[5]的SSUrRNA数据库[6]进行物种注释分析（设定阈值为0.8-1），获得分类学信息并分别在各个分类水平：kingdom（界）、phylum（门）、class（纲）、order（目）、family（科）、genus（属）、species（种）统计各样本的群落组成。以内参16S rRNA的数量为标准进行均一化处理，并统计奶酒酿制期间的门和属水平的群落组成、菌落的相对丰度。对OTU数据进行α多样性指数计算，并对结果进行对比分析。

2 结果与分析

2.1 细菌多样性的动态变化

2.1.1 Shannon指数变化情况

Shannon指数是衡量样品物种多样性的重要指标，也是α多样性指数之一。奶酒发酵醪加入到牛奶中发酵0、1、2、3、4、5、6、7、8、9d后的细菌Shannon指数如图1所示。细菌Shannon指数在奶酒发酵的过程中先下降后上升，第7天后又开始下降，在第2天降到最低点并显著低于其他发酵时间。这表明奶酒在酿制过程中，细菌的多样性先下降后上升再下降。

图1 细菌Shannon指数的动态变化

2.1.2 门水平上的菌群多样性变化

奶酒在酿制期间细菌门水平上的多样性变化情况如图2所示。在整个发酵过程中，共发现5个门，分别是变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、蓝藻门（Cyanobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria），其中，变形菌门和厚壁菌门占主导地位。厚壁菌门的相对丰度先升高，第3天达到峰值后开始下降，而变形菌门的相对丰度则先降后升，在第8天之后占绝对主导。变形菌门是细菌中最大的一门，包括很多病原菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺杆菌等著名的种类[7]。厚壁菌门多数为革兰氏阳性菌，包括常见的乳酸菌等食品发酵菌株。

图2 细菌门水平的相对丰度动态变化

2.1.3 属水平上的菌群多样性变化情况

奶酒在酿制期间细菌属水平上的多样性变化情况如图3所示。从图中可以看出，乳球菌属（Lactococcus）的相对丰度在发酵前期不断增长，到第3天达到峰值，为37.99%，然后开始下降并保持一定的比例。乳酸乳球菌是发酵工业中常用发酵剂之一，特别是在发酵乳制品中，被广泛应用于发酵乳制品的生产，如干酪、酸奶和奶油等[8]。乳酸乳球菌能够赋予发酵乳制品良好的质地和风味，具有极高的工业和经济价值[9]。假单胞菌属（Pseudomonas）的相对丰度也有较快的增长，在前3d为第一丰度菌群，最高为41.09%，后期并保持一定的比例。

图3 细菌属水平的相对丰度动态变化

2.2 真菌多样性的动态变化

2.2.1 Shannon指数变化情况

奶酒发酵醪加入到牛奶中发酵0、1、2、3、4、5、6、7、8、9d后的真菌Shannon指数如图4所示。真菌Shannon指数在奶酒发酵的过程中一直处于下降趋势，这表明真菌的多样性在减少。

图4 真菌Shannon指数的动态变化

2.2.2 门水平上的真菌多样性变化情况

经分析比对已得的OTUs，共鉴定到6个门（图5），分别是壶菌门（Chytridiomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、孢霉门（Mortierellomycota）、隐真菌门（Rozellomycota）、芽枝霉门（Mucoromycota）和子囊菌门（Ascomycota）。其中，芽枝霉门的相对丰度随着发酵时间的延长而不断下降，子囊菌门的相对丰度随着发酵时间的延长而不断增加。子囊真菌是单系真菌，约占所描述真菌的75%。在子囊菌中有一些著名的真菌：酿酒酵母、商业酵母等，其是烘焙和酿造工业的基础菌株。还有一些臭名昭著的子囊真菌，如黄曲霉菌。黄曲霉毒素是一种已知的最有效的天然致癌物[10]。

图5 真菌门水平的相对丰度动态变化

2.2.3 属水平上的真菌多样性变化情况

图6 真菌属水平的相对丰度动态变化

图6为奶酒酿制过程中属分类水平下的真菌动态变化情况。在发酵的前6d，丰度占比最高的为酵母菌属（Saccharomyces），其相对丰度基本保持在62%左右的水平。酵母菌属是一种形状呈细胞圆形、椭圆形或柱形的无性繁殖的重要真菌，能发酵葡萄糖、麦芽糖等糖类产生酒精，在酿酒工业中有着重要应用[11]。其次是曲霉属（Aspergillus），比例约为33%。曲霉属中部分菌种可将淀粉质原料转化成葡萄糖，而且糖化力强，繁殖速度快，热稳定性良好，耐酸，耐酒精，不产或少产可降低甲醇生成量的果胶酶。由于它们具有酶系丰富、产酶活性高、生长速度快、适应能力强、易于管理等特点，是酿酒微生物的重要组成部分[12]。

3 结论

奶酒在发酵过程中细菌的Shannon指数先下降后上升，在第2天降到最低点后开始上升，到第7天后又开始下降。在整个发酵过程中，共发现5个门，分别是变形菌门、厚壁菌门、蓝藻门、拟杆菌门、放线菌门。其中，变形菌门和厚壁菌门占主导地位。厚壁菌门的相对丰度先升高，第3天达到峰值后开始下降，而变形菌门的相对丰度则先降后升，在第8天后占绝对主导。乳球菌属的相对丰度在发酵前期不断增长，到第3天达到峰值，为37.99%，然后开始下降并保持一定的比例。

奶酒发酵过程中真菌的Shannon指数一直处于下降趋势，经分析比对已得的OTUs，共鉴定到5个门，分别是壶菌门、担子菌门、孢霉门、隐真菌门、芽枝霉门和子囊菌门。其中，芽枝霉门的相对丰度随着发酵时间的延长而不断下降，子囊菌门的相对丰度随着发酵时间的延长而不断增加。在发酵的前6d，丰度占比最高的为酵母菌属（Saccharomyces），其相对丰度基本保持在62%左右的水平，其次是曲霉属（Aspergillus），比例约为33%。本研究结果可为奶酒发酵菌株的分离、筛选和鉴定提供参考依据。