妊娠期糖尿病肠道菌群变化及临床价值分析

郑刘芳，刘清秀，李娟

(1.重庆市开州区人民医院产科，重庆 405425；2.成都市妇女儿童中心医院产科，四川 成都 610091)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠前糖代谢正常或有潜在糖耐量减退，但在妊娠期才出现或确诊一种糖尿病，在糖尿病孕妇中占比较大，高达80%，可明显增加先兆子痫、流产、早产、难产、巨大胎儿及畸形等妊娠不良结局发生率[1-2]。目前，国内大多数城市均开展了GDM筛查发现，GDM发生率日渐升高，娜仁其木格等[3]学者针对中国妊娠期糖尿病患病率进行Meta分析发现，不同地区妊娠期糖尿病患病率各不相同，以华北地区最高，约13%。但其发病机制仍不十分明确，可能与肥胖、遗传、炎性及脂肪细胞因子等有关[4]。2007年，“人类微生物组计划”被提出，随后随研究深入发现，肠道菌群与机体肥胖、炎症调控及糖尿病等多种代谢性疾病密切相关[5-6]，但其与GDM之间关系的研究较少。本研究以100例妊娠期糖尿病患者、100名正常妊娠人群和100名健康体检女性作为研究对象，探讨妊娠期糖尿病肠道变化规律，并分析其临床价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2016年1月至2018年6月于重庆市开州区人民医院产科收治的妊娠期糖尿病患者100例作为糖尿病妊娠组。妊娠期糖尿病诊断标准参照2011年ADA指南[7]：孕24～28周清晨空腹口服75 g葡萄糖后检测后续任一项达标即可，空腹血糖≥5.1 mmol /L，餐后1 h血糖≥10.0 mmol/L，餐后2 h血糖≥8.5 mmol /L；所有研究对象确诊后均给予相应干预治疗。排除：(1)既往妊娠期糖尿病病史；(2)孕前糖尿病、糖耐量异常、多囊卵巢综合征及慢性肠道疾病确诊史；(3)合并严重内科疾病者；(4)近1月内使用过抗生素或微生态调节剂等影响肠道微生态的药物者。选取同期年龄、孕周、孕次及产次等一般资料与之匹配的100名正常妊娠人群和100名健康体检女性作为正常妊娠组和对照组。本研究所有研究对象及家属均签署知情同意书，且通过本院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 入组但未给予任何治疗之前，收集糖尿病妊娠组空腹外周血及粪便。(1)空腹外周血收集。抽取空腹外周血5 mL于黄色血清管中，1 h内送检，3 000 rpm离心10 min，取上清进行血糖及胰岛素检测；(2)粪便标本收集。用灭菌棉签取早上自然排出新鲜粪便30～50 g于粪便采集专用管中，并于30 min内送检。正常妊娠组和对照组粪便采集方法同上。

1.2.2 血糖相关指标检测 本研究中血糖相关指标主要包括空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)和空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)。其中FBG采用美国雅培c1600全自动生化仪，FINS采用德国罗氏E160电化学发光分析仪。

1.2.3 肠道菌群检测 (1)提取粪便DNA。采用粪便DNA提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)进行检测，具体步骤如下：取20 g粪便与1.4 mL GSL缓冲液混合后置于70 ℃温浴5 min，后于震荡仪上振荡15 s，后以12 000 rpm离心1 min，弃上清，加入15 μL蛋白酶proteinase K和200 μL GB缓冲液，后70 ℃温浴10 min，再加无水乙醇沉淀DNA，最后50 μL用TB洗脱缓冲液洗脱DNA过柱。(2)DNA质量检测。采用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测上述DNA浓度，当A260/A280比值为1.8～2.0即为合格，本研究所有DNA提取物均合格。(3)粪便细菌通用16SrDNA基因PCR扩增及文库构建：采用粪便细菌通用16SrDNA V4区通用引物进行PCR扩增，后将PCR扩增产物纯化后连接pGEM-T Easy Vector，后将连接产物电转化至宿主菌，后将转化子涂在SOB/氨苄青霉素平板上(含IPGT和X-Gal)，过夜培养，筛选阳性克隆送深圳华大基因公司进行测序。

1.2.4 观察指标 收集糖尿病妊娠组FBG和FINS，并计算胰岛素抵抗指数(insulin resistance,IR)=FBG×FINS/22.5；收集各组肠道菌群物种及优势菌群，并计算其比例；收集各组妊娠不良结局情况，包括先兆子痫、流产、早产、难产、巨大胎儿及胎儿器官发育异常等。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组肠道菌群中优势菌群比例比较

本研究共鉴定出9门属肠道内细菌，各组均以厚壁菌门、拟杆菌菌门、变形菌门和放线菌门为主，3组肠道菌群种各优势菌门属比例比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 血糖相关指标与肠道菌群优势菌门属的关系

经Spearman相关分析，FBG、FINS和IR与厚壁菌门和放线菌门均呈明显正相关(P<0.05)，而FBG、FINS和IR与拟杆菌菌门和变形菌门呈明显负相关(P<0.05)。见表2。

2.3 各组妊娠不良结局情况比较

与正常妊娠组比较，糖尿病妊娠组妊娠不良结局总发生率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表1 3组肠道菌群优势菌群比例比较

*P<0.05，与对照组相比；#P<0.05，与正常妊娠组相比。

表2 血糖相关指标与肠道菌群优势菌门属的关系

表3 3组妊娠不良结局情况比较[n(%)]

2.4 妊娠不良结局与肠道菌群优势菌门属的关系

与正常妊娠结局组比较，不良结局发生组肠道菌群中厚壁菌门和放线菌门比例明显升高，而拟杆菌菌门、变形菌门和其它菌门比例则明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 妊娠不良结局与肠道菌群优势菌门属的关系

3 讨论

妊娠期女性激素、免疫、代谢等均可发生一系列变化，包括体重增加、血糖、瘦素、胰岛素及胆固醇等水平增高，甚至出现严重胰岛素抵抗，最终导致GDM发生[8-9]。 肠道菌群是指寄居在人体胃肠道内，从出生即开始建立形成，并随着生长发育而不断完善的正常菌群；至今为止，共发现1014个微生物，是人体细胞总数的10倍，以厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门、疣微菌门和梭杆菌门等6种优势菌群为代表[10-11]。研究发现，肠道菌群可产生短链脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFA)、维生素B及维生素K等营养物质，与机体代谢、能量平衡及免疫调节等密切相关[12]。有学者发现，SCFA可调控胰岛β细胞分泌抗菌肽分泌，提示肠道菌群可通过直接影响胰岛免疫环境直接参与糖尿病的发生[13]。但关于妊娠期糖尿病肠道菌群变化及临床价值探讨较少。

在本研究中，共检出9门属肠道内细菌，其中厚壁菌门、拟杆菌菌门、变形菌门和放线菌门构成比例达90%以上，与前述结论基本一致，提示肠道菌群稳定性好，妊娠并未造成肠道菌群结构类型紊乱。 糖尿病妊娠组、正常妊娠组和对照组各优势菌门属比例比较差异明显，提示肠道菌群对妊娠期糖尿病有一定诊断价值。其中正常妊娠组和对照组各优势菌门属比例比较，差异亦有统计学意义(P<0.05)，这是因为妊娠期代谢机能发生变化，肠道菌群构成及比例也随之改变[14]。正常妊娠组和糖尿病妊娠组比较，厚壁菌门和放线菌门比例升高明显，而拟杆菌菌门等其它菌门相对下降，其中尤以厚壁菌门比例变化明显，这可能是因为厚壁菌门可发酵膳食纤维产生许多SCFA，通过调节胃肠道激素分泌、胰岛素敏感性及糖脂代谢等参与糖尿病发生[15]；而拟杆菌菌门和变形菌门比例下降，其所抑制的TNF-α和IL-6等炎症因子则明显上升，使机体处于低炎症水平，可诱发GDM发生[16]。此外，本研究经Spearman相关分析发现，血糖相关指标FBG、FINS和IR与厚壁菌门和放线菌门均呈明显正相关，而FBG、FINS和IR与拟杆菌菌门和变形菌门呈明显负相关，与上述观点基本一致。在本研究中，妊娠期糖尿病患者妊娠不良结局发生率约15%，明显高于正常妊娠者，说明妊娠期糖尿病在一定程度上可增加妊娠不良结局发生率，与国内外结论一致。而本研究主要比较了妊娠不良结局女性与正常妊娠结局女性肠道菌群发现，与正常妊娠结局组比较，不良结局发生组肠道菌群中厚壁菌门和放线菌门比例明显升高，而拟杆菌菌门、变形菌门和其它菌门比例则明显下降，提示肠道菌群变化在妊娠期糖尿病发生中占有一定地位，其中厚壁菌门和放线菌比例升高可增加妊娠期糖尿病发生概率，为临床工作者预测妊娠期糖尿病患者妊娠结局提供参考。

综上认为，与正常妊娠女性比较，妊娠期糖尿病患者肠道菌群结构及比例改变明显，对其诊断及妊娠不良结局预测有一定价值。样本量及样本收集范围是本研究限制点，后续将扩大样本量及收集范围，进一步完善结论。