一例支原体和大肠杆菌混合感染奶牛乳房炎的诊断

2020-05-08刘琴张泉鹏周亚平孟兴祥成玉梅施开平李国平彭雅婷

中国奶牛 2020年4期

刘琴，张泉鹏，周亚平，孟兴祥，成玉梅，施开平，李国平，彭雅婷

（1.昆明市动物卫生监督所，昆明 650401；2.云南省嵩明县动物卫生监督所，嵩明 651700）

支原体旧称霉形体，是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器、可用人工培养基培养增殖的最小原核细胞型微生物，大小为0.1～0.3μm。支原体广泛存在于人和动物体内，能够引起奶牛肺炎、关节炎、乳房炎、生殖器官炎症等，1961年首次在美国奶牛乳房炎中分离到支原体，在我国1983年首次报道了奶牛乳房炎乳中分离到支原体。支原体感染的乳房炎病程长，治疗费用高。大肠杆菌乳房炎在临床上很常见，主要是由于环境卫生差、消毒不彻底以及挤奶操作不当所造成。2019年5月，昆明市某奶牛场发生了一起乳房炎病例，共3头发病，临床表现为乳房肿硬、乳区发热，乳汁黄色呈豆腐渣或絮状。经细菌分离鉴定和奶牛乳房炎四重PCR诊断为大肠杆菌和支原体混合感染。现将其报告如下。

1 材料

1.1 病料

用无菌注射器抽取病牛乳房中乳汁，共3头牛的3份患乳区混合样品。

1.2 仪器

全自动细菌鉴定仪（VITEK 2 COMPACT，法国梅里埃）、冷冻离心机（贝克曼）、荧光定量PCR仪（STEP ONE PLUS美国ABI，无Cy5荧光通道），生化培养箱（上海一恒）。

1.3 试剂

普通琼脂培养基、血平皿、革兰氏阴性生化鉴定卡（法国梅里埃）、革兰氏阴性细菌药敏卡片（法国梅里埃），4联牛乳房炎病原菌核酸检测试剂盒（含DNA提取试剂，深圳易瑞），革兰氏染色液（环凯生物）。

2 方法

2.1 细菌分离和革兰氏染色鉴定

2.1.1 细菌培养

灭菌划线法将乳汁分别接种于普通琼脂平皿和血平皿上，37℃培养24～48h。

2.1.2 革兰氏染色及鉴定

挑取典型菌落按照革兰氏染色法进行染色，镜检初步确定细菌的形态和革兰氏阴性或阳性。

2.2 细菌鉴定和药敏试验

将经分离鉴定的可疑菌株用普通琼脂平板纯培养，37℃培养24h。无菌挑取纯培养物混悬于3mL无菌生理盐水（0.45%NaCl溶液）中，用比浊管配置相当于与0.50～063麦氏单位的菌悬液。按照全自动细菌鉴定仪操作说明书对可疑菌落进行鉴定和药敏试验。革兰氏阴性细菌鉴定卡为47种生化反应，药敏试验为18种常用抗生素和ESBL（产β-内酰胺酶）。

2.3 乳汁核酸提取和PCR检测

按照PCR检测试剂盒的说明书进行DNA提取和荧光PCR检测。4联乳房炎试剂盒采用4重Q-PCR技术，通过PCR MIX金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、牛支原体、牛棒状杆菌等4种病原菌检测。金黄色葡萄球菌（Sau）报告荧光为FAM；无乳链球菌（Sag）报告荧光为JOE；牛支原体（Myb）报告荧光为ROX；牛棒状杆菌（Cb）报告荧光为Cy5。由于荧光定量PCR仪（STEP ONE PLUS）无Cy5通道，用VIC通道替代。

反应体系设为2 5 u L，反应程序为：去污染（50℃，3min）、预变性（95℃，3min）、扩增（95℃，15s；60℃，40s），40个循环。

质量控制：

阴性对照：PCR反应液1的FAM通道、JOE通道、ROX通道、Cy5通道均无扩增曲线，个别通道的阴性对照出现翘尾信号，Ct值≥35时，不影响结果判读。

阳性对照：PCR反应液1的FAM通道、JOE通道、ROX通道、VIC通道均有扩增曲线，Ct值均≤30。

结果判断：Ct小于或等于36（无乳链球菌Ct小于或等于34）判为阳性，Ct在36～38之间（无乳链球菌Ct在34～38）判断为可疑，Ct大于38判为阴性。结果保留整数部分。

3 结果与讨论

3.1 细菌分离及鉴定结果

经细菌培养，普通琼脂平板和血平皿上均长出边缘整齐，圆形，湿润、光滑、呈灰白色的菌落，血平皿无典型溶血。对分离到的9个菌株经革兰氏染色，镜检发现均为短粗、两端钝圆的阴性杆菌。经对该细菌采用革兰氏阴性鉴定卡进行自动细菌鉴定，系统显示该菌株为大肠杆菌（符合率达到99%）。大肠杆菌是奶牛乳房炎的主要病原菌之一，临床上感染病例较普遍。葛影影等调查河南地区奶牛乳房炎的主要致病菌，分离到11种287株致病菌，其中大肠杆菌是主要致病菌之一，占总检出数的5.57%[1]。廖智慧等从衡水地区不同的奶牛场采集60份患乳房炎奶牛奶样，分离鉴定出20株大肠杆菌[2]。

3.2 细菌药敏试验鉴定结果

梅里埃全自动药敏试验鉴定结果显示，ESBL阴性，对常用的头孢类、氟喹诺酮、磺胺类、氨基糖苷类抗生素都较敏感，说明该大肠杆菌菌株不产β-内酰胺酶。这与其他报道的结果有差异，许有盼对乳房炎中得到的大肠杆菌药敏结果显示，对氟苯尼考、头孢曲松、头孢他啶、恩诺沙星4种药物高度敏感；对新霉素、庆大霉素、多西环素、阿莫西林、阿米卡星、青霉素、卡那霉素7种药物耐药[3]。武军元等在新疆阿克苏地区从患有乳房炎的奶牛病例中分离到的大肠杆菌，经耐药性检测表明，对氨苄西林的耐药性最高，达到了50%；对多西环素、四环素和链霉素的耐药性次之，为40%；而对环丙沙星、阿米卡星、诺氟沙星则比较敏感[4]。廖智慧等的药敏试验结果显示，大肠杆菌对头孢克肟、恩诺沙星、丁胺卡那、强力霉素4种药物敏感，对其他药物存在不同程度的耐药性[2]。细菌的耐药性与滥用抗生素有关，该大肠杆菌耐药性不强的原因可能与该场建厂年限短、用药比较规范有关。

3.3 荧光定量PCR诊断结果

经对3份乳样进行DNA提取和PCR扩增荧光检测，四种细菌Ct结果见表1。

表1 乳样中四种细菌荧光PCR检测结果

从表1可见，1、2号样品支原体Ct分别为27、24，3号样品无支原体扩增曲线，其他三种细菌未见扩增曲线，判定为支原体感染。3号样品未检测到支原体原因可能是该牛发病较早，一直采用中药制剂治疗，奶牛已处于康复期。由于荧光定量PCR仪（STEP ONE PLUS）无Cy5通道，用VIC通道替代，阳性对照Ct显示为27，说明有一定参考意义。支原体在环境中较普遍，是奶牛乳房炎常见的致病性微生物[5～8]。夏文华对甘肃省张掖市临泽县奶牛支原体感染情况调查显示，奶牛血清样品支原体平均阳性率50.71%[9]。曾伟权在乳房炎临床症状的奶牛中采集牛奶样本，经细菌培养和支原体培养、菌落形态观察、生化试验、特异性PCR鉴定和16SrRNA测序对分离株进行鉴定，证实为支原体乳房炎[10]。

3.4 用药建议

细菌分离鉴定和荧光PCR诊断结果说明，该乳房炎为支原体和大肠杆菌混合感染。结合药敏试验的结果和支原体敏感的抗生素种类，推荐该场采用氟喹诺酮类抗生素等治疗该乳房炎。由于牛支原体对大部分抗生素不敏感，大部分在体外药敏结果中表现敏感的抗生素，在治疗时效果均不理想，这也可能与奶牛血乳屏障阻碍了药物进入乳腺有关。彭清洁等认为，支原体治疗要对症治疗，如发热可用安乃近、复方氨基比林等解热药；体质弱的牛要补充能量和VC及复合VB、ATP等[6]。