发酵牦牛乳蛋白肽的分离纯化及抗氧化活性研究

（云南农业大学食品科学技术学院，昆明 650201）

牦牛发酵乳风味独特，口感细腻，富含维生素C、B族维生素、游离钙、氨基酸等生物活性物质，具有良好的医疗保健功能和美容功效[1]。牦牛乳在发酵过程中乳酸菌产生的蛋白酶(复合)降解蛋白质，可达到较高的水解度，其分解的蛋白质多肽有酪新素[2]、酪激肽[3]、降血压肽[4]、乳铁蛋白肽[5]、凝血素抑制肽[6]等及一些还没被具体鉴定的功能肽。

自由基具有强氧化性，可损害机体的组织和细胞[7,8]，引起衰老和慢性疾病，如心血管疾病、癌症和糖尿病等[9,10]。抗氧化肽对自由基有良好的清除作用，可缓解自由基对机体造成的损伤。近年来，抗氧化肽的开发成为国内外的研究热点，如从动物蛋白源中酶解或提取乳源抗氧化肽[11,12]、火腿抗氧化肽[13]等。

天然生物活性肽通常采用直接分离提取法、化学合成法、微生物发酵法、蛋白质酶解法等方法来来制备。目前，通过发酵释放肽的天然方式制备蛋白肽备受关注。段楠等[14]用干酪乳杆菌发酵豆乳制备抗氧化肽和ACE抑制肽；Chang等[15]使用长双歧杆菌发酵牛酪蛋白制备抗氧化活性肽；杨丽娜等[16]使用植物乳杆菌和嗜热链球菌复合菌株发酵羊乳制备抗氧化肽。目前，多肽分离纯化的方法主要有: 超滤法[17]、凝胶色谱层析[18]、离子交换层析、吸附层析及高效液相色谱[19]等。但目前对牦牛发酵乳中蛋白肽的研究较少，本研究通过筛选蛋白降解能力较好的乳酸菌发酵牦牛乳制备抗氧化肽，通过超滤分离制备分子量5ku以下的蛋白肽样品，进一步优化Sephadex-25层析柱分离条件，制备具有较高抗氧化活性的发酵牦牛乳蛋白肽组分，并测定其体外抗氧化活性，以期为进一步研究牦牛乳抗氧化肽奠定基础，同时为功能性乳制品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料

牦牛乳：采自香格里拉高山牧场；Sephadex-25葡聚糖凝胶，北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2 菌株

CICC 6063嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、CICC 20264植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、CICC 20241副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、CICC 20262干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、CCTCC M 204058约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，均保藏于云南农业大学食品科学技术学院，使用前活化。

1.1.3 试剂

10% TCA、茚三酮显色液、2,2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH）、2,2-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS），上海晶纯生化科技股份有限公司；谷胱甘肽（GSH）标准品（HPLC≥98%），上海源叶生物科技有限公司。

1.1.4 仪器与设备

URA14M0018分光光度计，上海翱艺仪器有限公司；TGL20M高速冷冻离心机，湖南湘立科学仪器有限公司；SVJ-358智能商用型酸奶机，北京世纪阳光科技发展有限公司；UL40BC乳成分分析仪，杭州浙大优创科技有限公司；SW-CJ-IF单人双面超净无菌操作台，苏州江东精密仪器有限公司；HPX-9272ME恒温培养箱，上海博讯实业有限公司；GMSX-280压力蒸汽灭菌器，北京市永光明医疗仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 发酵牦牛乳菌株的筛选

以水解度和肽得率为指标，从6株乳酸菌中筛选出发酵牦牛乳高产蛋白肽和高水解度的菌株，结合保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和发酵乳杆菌发酵牦牛乳制备蛋白肽。

1.2.1.1 发酵牦牛乳的研制

原料乳→预热（60～65℃）→均质（8～10MPa）→灭菌(85℃,15min)→冷却（30～45℃）→接种→发酵（30℃，30h）→冷藏后熟（2～4℃,12h）→成品。

1.2.1.2 水解度测定

稀释到适当浓度的发酵牦牛乳水解液，加入1mL茚三酮显色液，置于沸水浴中加热15min，然后冷却，再加入5mL 40%的乙醇溶液混匀，放置15min后，用1cm的比色皿以蒸馏水代替样品作空白调零，在570nm处测定吸光度[20]。标准曲线回归方程为：y=0.0335x+0.0469（3～21μg/mL，R2=0.998；y为吸光度，x为甘氨酸浓度）。

水解度的计算公式：DH=h/htot×100%

(htot是指每克纯蛋白中肽键的毫摩尔数，为常数8.3mmol/g，由标准曲线可知h值)。

1.2.1.3 多肽含量测定

参考徐娟等[21]的方法进行测定。取2.5mL牦牛发酵乳离心提取液，加入2.5mL配制好的10%（w/v）三氯乙酸溶液，均匀混合，试管中样品静置20min，然后离心10min（3500r/min）。取上述溶液2.0mL于试管中，加入配制好的双缩脲试剂3.0mL（样液∶双缩脲试剂=2:3，v/v），均匀混合，在60℃水浴条件下显色5min，然后离心10min（2000r/min）。取上清液，在310nm处测定吸光值，计算多肽含量。标准曲线方程为：y=4.408x-0.1324（R2=0.9993；y为吸光度，x为谷胱甘肽浓度）。

1.2.2 发酵牦牛乳蛋白肽的制备

取按1.2.1.1制备且经冷藏后熟的发酵牦牛乳于4℃4000×g离心20min，取上清液，用5ku超滤膜低温过滤，收集分子量＜5ku的发酵牦牛乳蛋白肽，冷冻干燥制得冻干粉，备用。

1.2.3 发酵牦牛乳蛋白肽的分离纯化

采用SephadexG-25葡聚糖凝胶进行蛋白肽的分离，将处理好的葡聚糖凝胶装柱平衡后加入一定浓度的牦牛乳蛋白肽溶液，连接好SBS-100数控计滴自动部分收集器，收集分离液，测定220nm下的吸光值，绘制分离色谱图。通过单因素实验优化Sephadex-25色谱柱分离的洗脱液（NaCl）浓度、流速、上样浓度。

1.2.3.1 NaCl洗脱液浓度的筛选

分别使用0.1、0.15和0.2mol/L NaCl溶液进行洗脱，绘制特征吸收峰的出峰图，根据洗脱峰型确定最佳洗脱液浓度。

1.2.3.2 洗脱流速的筛选

分别在0.5、1.0和2.0mL/min洗脱流速下进行洗脱，绘制特征吸收峰的出峰图，根据洗脱峰型确定最佳洗脱流速。

1.2.3.3 上样浓度的筛选

分别对Sephadex-25 柱加载质量浓度为30、40和50mg/mL的发酵牦牛乳蛋白肽样液，绘制特征吸收峰的出峰图，根据洗脱峰型确定最佳上样浓度。

1.2.4 体外抗氧化活性测定

参考杨瑞文[22]的方法进行 ABTS自由基清除率测定；参考Lin等[23]的方法进行 DPPH自由基清除率测定；参考Oyaizu[24]的方法并加以改良，进行还原能力测定；参考朱晓宦等[25]的方法进行羟自由基清除率测定。

1.2.5 体外抗氧化活性IC50值的测定

将发酵牦牛乳蛋白肽各分离组分配制成0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL的不同质量浓度试验点（≥5），分别测定其ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率、还原能力、羟自由基清除率。以发酵牦牛乳蛋白各分离组分肽浓度为横坐标，测定值为纵坐标，绘制拟合曲线，从曲线中计算出IC50值。

1.3 数据处理及统计分析

采用Origin 2017和Excel 2016对实验数据进行整理，利用SPSS 24对数据进行方差显著性分析。

2 结果与分析

2.1 发酵牦牛乳高产多肽菌株的筛选

发酵法通过微生物发酵过程产生的蛋白酶降解蛋白质，可达到较高的水解度，从而降低酶法生产低聚肽的成本。该方法已成为近年来研究肽制备工艺的热点。各菌株组合发酵牦牛乳的水解度和肽得率如图1所示。

图1 发酵牦牛乳高产多肽菌株筛选

由图1可以看出，6株乳酸菌在相同条件下发酵牦牛乳的肽得率和水解度各不同，且水解度与肽得率具有一定的相关性。罗伊氏乳杆菌和约氏乳杆菌具有较强的蛋白水解能力和产多肽能力，原因可能是这两株菌能产生胞外蛋白酶将大分子酪蛋白水解成多肽。这两株菌结合保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、发酵乳杆菌发酵的牦牛乳水解度和肽得率为分别19.10%、15.37%和481.2μg/mL、442.56μg/mL。马岚等[26]通过副干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌及嗜热链球菌发酵羊乳制备出还原能力、总抗氧化能力、DPPH自由基清除率较强的羊乳蛋白肽，与本研究存在差异，可能是因为原料乳不同以及乳酸菌筛选条件的不同。

2.2 发酵牦牛乳蛋白肽的分离纯化

2.2.1 上样浓度对Sephadex-25层析分离发酵牦牛乳蛋白肽的影响

上样浓度对Sephadex-25层析分离效果的影响较大，浓度过高会增大溶液的黏度，使分子运动受到限制，但上样浓度过小，分离后各组分含量较少，实验效率低。当洗脱液为0.1mol/LNaCl、流速为1mL/min，上样质量浓度分别为30、40、50mg/mL时，Sephadex-25层析分离发酵牦牛乳蛋白肽色谱图如图2所示。

从图2中可看出，当浓度为30、40mg/mL时，第一个特征吸收峰较好，但第二个特征吸收峰的洗脱率较低，造成洗脱液的浪费。当质量浓度为50mg/mL时，两个峰峰型对称，出峰面积大，分离效果都较好。综合考虑，选择最佳上样质量浓度为50mg/mL。三个上样浓度下色谱峰都出现拖尾现象，原因是洗脱液流速太低，后续应进行洗脱流速的优化。

图2 不同样品质量浓度Sephadex-25分离色谱图

2.2.2 NaCl洗脱液流速对Sephadex-25层析分离发酵牦牛乳蛋白肽的影响

图3 不同洗脱液流速Sephadex-25分离色图谱

流速对葡聚糖凝胶色谱的分离纯化有一定的影响，流速过快，易导致柱压升高、峰拖尾等现象，分离效果不好，而流速过慢会导致扩散加剧，从而影响分离效果，而且过慢的流速会出现样品扩散、谱峰变宽，延长分离时间，降低各分离组分的浓度。当NaCl浓度为0.15mol/L、上样浓度为50mg/mL，洗脱流速分别为1、2、2.5mL/min时，Sephadex-25层析分离发酵牦牛乳蛋白肽色谱图如图3所示。

从图3可看出，随着洗脱流速的增加，特征吸收峰的出峰时间提前。在流速为1mL/min时，第一个和第二个特征吸收峰明显降低，峰形较宽，这可能是由于较低流速引起样品扩散，引起峰拖尾等副作用所造成的；在流速为2.5mL/min时，第一个和第二个特征吸收峰洗脱脱率升高，出峰时间早，但峰2出现前沿，和峰1的分离度相对较低。在2.0mL/min流速下，分离出来的两个特征吸收峰峰型和分离状态良好，出峰面积大，提高了洗脱效率，因此选择最佳洗脱流速为2.0mL/min。

2.2.3 NaCl洗脱液浓度对Sephadex-25层析分离发酵牦牛乳蛋白肽的影响

当洗脱液流速为2mL/min、上样质量浓度50mg/mL，NaCl洗脱液浓度分别为0.1、0.15、0.20mol/L时，Sephadex-25层析分离发酵牦牛乳蛋白肽色谱图如图4所示。

图4 不同洗脱液浓度Sephadex-25分离色图谱

从图4中可看出，NaCl洗脱液浓度为0.10mol/L时，出峰面积相对较小，可能的原因是NaCl浓度过低未能把多肽洗脱下来。当用浓度为0.15、0.2mol/L的NaCl洗脱液进行洗脱时，出峰面积较大，峰型也相对较好，但浓度为0.2mol/L时的峰面积最大，因此选用浓度为0.20mol/L的NaCl溶液为最佳洗脱浓度。

2.2.4 发酵牦牛乳蛋白肽分离纯化最佳工艺条件

在最佳的上样浓度、洗脱液浓度和洗脱液流速下，经多次分离得到的最佳发酵牦牛乳蛋白肽的Sephadex-25分离色谱图如图5所示。

图5 发酵牦牛乳蛋白肽最佳分离色图谱

根据单因素实验确定Sephadex-25层析色谱分离最佳洗脱工艺为：洗脱液浓度0.2mol/L，上样质量浓度50mg/mL，洗脱流速2mL/min。在此条件下的峰分离度较好，峰型对称（图5）。在最佳分离条件下大量收集峰1和峰2组分，透析48h后，浓缩冷冻干燥，-80℃冰箱保存备用。

2.3 发酵牦牛乳蛋白肽体外抗氧化活性

2.3.1 ABTS自由基清除能力

发酵牦牛乳蛋白肽各组分在不同质量浓度下的ABTS自由基清除率如图6所示。

图6 各组分ABTS自由基清除率

表1 各组分ABTS自由基清除率的IC50

由图6可知，随着发酵牦牛乳蛋白肽各组分浓度的提高，ABTS自由基清除活性显著增强，分离组分峰1的ABTS自由基的清除能力较强，在质量浓度为2mg/mL时，ABTS自由基的清除率为53.37%，而峰2和分子量＜5ku的牦牛酸奶蛋白肽组分的ABTS自由基清除率相对较弱，分别为26.38%、38.15%。三个组分的ABTS自由基清除能力IC50如表1所示，其中，峰2的IC50最高，为3.844mg/mL，分子量＜5ku的IC50居中，为2.554mg/mL，差异显著（P＜0.05），峰1的IC50最低，为1.778mg/mL。

2.3.2 DPPH自由基清除能力

发酵牦牛乳蛋白肽各组分在不同质量浓度下DPPH自由基清除率如图7所示。

图7 各组分DPPH自由基清除率

表2 各组分DPPH自由基清除率的IC50

由图7可知，发酵牦牛乳分离得到的各组分均具有清除DPPH自由基的能力，且DPPH自由基清除活性与蛋白肽浓度呈正相关关系。在质量浓度为2mg/mL时，发酵牦牛乳蛋白肽组分峰1、峰2和分子量＜5ku发酵牦牛乳蛋白肽对DPPH自由基的清除率分别为：53.02%、29.90%和43.32%，其中峰1的DPPH自由基清除率最强。三个组分的DPPH自由基清除能力IC50如表2所示。其中，峰2的IC50最高，为3.286mg/dL，分子量＜5ku的IC50居中，为2.296mg/mL，峰1的IC50最低为1.801mg/mL（P＜0.05）。

2.3.3 还原能力

发酵牦牛乳蛋白肽各组分在不同质量浓度下的还原能力如图8所示。

图8 各组分还原能力

表3 各组分还原能力的IC50

由图8可知，发酵牦牛乳蛋白肽各组分都有一定的还原能力，还原能力与其浓度成量效关系。其中峰1的还原能力最强，在质量浓度为2mg/mL时，其还原能力为1.093，峰2和分子量＜5ku发酵牦牛乳蛋白肽的还原能力较弱，分别为0.668和0.888。三个组分的还原能力IC50如表3所示。其中，峰2的IC50最高，为1.365mg/mL，分子量＜5ku的IC50居中，为0.869mg/mL，峰1的IC50最低，为0.571mg/mL（P＜0.05）。

2.3.4 羟自由基清除能力

发酵牦牛乳蛋白肽各组分在不同质量浓度下的羟自由基清除能力如图9所示。

图9 各组分羟自由基清除率

表4 各组分羟自由基清除能力的IC50

根据图9可以看出，发酵牦牛乳蛋白肽各组分羟自由基清除率与其浓度呈明显的正相关。其中峰1的自由基清除能力最强，在质量浓度为2mg/mL时，峰1、峰2和分子量＜5ku发酵牦牛乳蛋白肽对羟自由基的清除率分别为：79.15%、38.06%和52.86%。三个组分的羟自由基清除能力IC50如表4所示。其中，峰2的IC50最高，为2.466mg/mL，分子量＜5ku的IC50居中，为1.818mg/L，峰1的IC50最低，为0.913mg/mL（P＜0.05）。

杜昕等[27]通过超滤得到分子量小于5ku的牦牛血抗氧化肽具有最高的抗氧化活性，且经过Sephadex G-25层析后得到4个组分，其中组分Ⅰ抗氧化活性最高。高维东等[28]通过超滤、Sephadex G-15和高效液相色谱分析表明，牦牛酪蛋白抗氧化肽主要集中在200～2 500u之间。本试验通过超滤得到分子量小于5ku的发酵牦牛乳抗氧化肽，再经过 Sephadex G-25层析分离后得到2个组分，其中峰1的抗氧化活性最高，说明抗氧化肽活性与其分子量有一定关系，但并非分子量越小，抗氧化活性越高，抗氧化活性还应与原料蛋白特点及酶切位点等有关。

3 结论

试验从6株乳酸菌中筛选出对发酵牦牛乳具有较高水解度及肽得率的罗伊氏乳杆菌和罗伊斯乳杆菌，并与保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和发酵乳杆菌按1:1:1:1:1复配发酵剂制备牦牛乳蛋白肽。发酵牦牛乳蛋白肽Sephadex-25层析色谱分离的最佳条件为：洗脱液浓度0.2mol/L，上样质量浓度50mg/mL，洗脱流速2mL/min，一共分离出峰1、峰2两个组分。随着蛋白肽各分离组分质量浓度的增加，其抗氧化活性显著增强，组分峰1、峰2对ABTS自由基清除率的IC50为1.778mg/mL、3.844mg/mL，对DPPH自由基清除率的IC50为1.801mg/mL、3.286mg/mL，还原能力IC50为0.571mg/mL、1.365mg/mL，对羟自由基清除率的IC50为0.913mg/mL、2.466mg/mL。