离子色谱法测定生乳中硫氰酸根的方法研究

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业农村部奶及奶制品质量安全控制重点实验室/农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京）/农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京），北京 100193）

硫氰酸钠是一种易溶于水的白色斜方系结晶或粉末，在水中溶解产生硫氰酸根离子（SCN-）和钠离子（Na+）。因其具有保鲜防腐的功能，在上个世纪80年代，硫氰酸钠作为一种食品添加剂，被普遍应用于乳制品行业。硫氰酸钠的保鲜作用，主要是通过硫氰酸根与乳过氧化物酶作用，阻碍细菌的正常代谢途径，从而达到抑制细菌的作用[1]。由于受到当时冷链运输技术不发达及运输成本高、乳制品企业路途较远等因素的限制，生乳在收购和运输过程中很容易发生酸败变质。考虑到成本低廉、易添加等因素，很多人通过联用过氧化氢和硫氰酸钠来对牛乳进行保鲜，这大大地促进了硫氰酸钠在乳制品行业，尤其是生乳收购过程中的使用率，进而成为遗留至今的问题。2008年12月卫生部发布的第一批“违禁及滥用食品添加剂品种名单”中明确规定乳及乳制品中硫氰酸钠属违法添加物质[2]。

硫氰酸根是典型的类卤素，带负电荷，直线型，多电子离子，与其他原子有较强的络合性。大多数文献资料中报道硫氰酸钠的测定分析方法有可见分光光度法[3,4]、气相色谱法[5]、气相质谱联用法[6]、液相色谱法[7-8]、离子色谱法[9～12]和试剂盒法[13]。其中，分光光度法操作简便、成本低廉，但存在显色不稳定、灵敏度低、重现性差的缺点，气相色谱法需要衍生，且污染环境[1]。试剂盒法检出限过高，无法精确定量。离子色谱法具有精密度高、选择性好和操作简便的特点，可同时实现多组分阴离子分离[14]。

离子色谱分离技术是继液相色谱、气相色谱后的第三大色谱分离技术，主要应用于无机离子的分离和测定[15]。在食品、添加剂、医药、环境、地质各领域都得到了广泛的拓展和应用[16～19]，并成为该领域检测的标准分析方法。离子色谱法通过采用离子交换的原理，用低交换容量的新型离子交换分离柱分离样品离子，并在分离柱后串接一根高交换容量的特制抑制柱，通过化学反应把具有高电导的淋洗液转换成低电导的淋洗液，促使电导检测器能灵敏、方便地检测出被分离的离子[20]。离子交换色谱适用于易于极化且疏水性强的无机、有机阴离子和阳离子的分离。其分离过程主要是在电场力的作用下，流动相中所带离子和固定相上的亲和离子相互交换的过程，阴离子分离的交换树脂为季胺基的交换树脂。本研究采用离子色谱法，对淋洗液、色谱柱、选择性、前处理条件、线性范围、方法检出限与定量限、实验室内加标回收率与精密度、实验室间加标回收率与精密度、标准溶液保存稳定性、生乳样品保存稳定性与制备等方面进行了系统优化和考察。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈，色谱纯，Fisher；硫氰酸钠（NaSCN，CAS：540-72-7），纯度≥99.99%，SIGMA；微孔过滤器，0.22μ m，安普；RP柱，1.0mL，Thermo。

1.2 仪器与设备

离子色谱仪，配电导检测器，戴安公司；高速冷冻离心机，8 000r/min，4℃，日立；分析天平，感量0.1mg、0.01g，赛多利斯；涡旋混匀器，IKA；烘箱，80℃±5℃，MEMMERT；超纯水机，MILLIPORE。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

表1 离子色谱仪淋洗液梯度淋洗条件

色谱柱：氢氧化物选择性、疏水性低且可兼容梯度洗脱的高容量阴离子交换柱，Dionex IonPac AS16型色谱柱（4mm×250mm）和Dionex IonPac AG16型保护柱（4mm×50mm）；抑制器：Dionex ASRS-300 4mm阴离子抑制器，外加水抑制模式，抑制器电流为112～149mA，外加水流量1.2mL/min；淋洗液：氢氧化钾溶液，梯度淋洗，流速为1.0mL/min。色谱淋洗液梯度淋洗条件参见表1。进样体积：100μL；柱温：30.0℃；电导池温度：35.0℃。

1.3.2 标准溶液的制备

硫氰酸根标准储备液（1000mg/L）：将硫氰酸钠于80℃烘箱内烘干2h，准确称取干燥后的硫氰酸钠0.1397g，用水定容至100mL，混匀。0～4℃保存，有效期为6个月。

硫氰酸根标准中间液（10mg/L）：准确吸取1.00mL硫氰酸根标准储备液，用水定容至100mL，混匀。0～4℃保存，有效期为1个月。

硫氰酸根标准工作液：分别吸取硫氰酸根标准中间液0、10、20、50、100、500和1 000μL，用水定容至10mL，混匀，得到浓度分别为0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.50和1.00 mg/L的硫氰酸根标准工作液。0～4℃保存，有效期为1个月。

1.3.3 样品处理

将样品充分恢复至室温，称取4.00g（精确至0.01g）样品，用乙腈定容至10mL，涡旋混匀1min，静置20min，置于离心机上以8 000r/min、4℃离心5min。离心后，准确移取1.00mL上清液用水定容至10mL，混匀。取上述溶液依次过0.22μm过滤器、RP柱，弃去前3mL滤液，收集后面的滤液。将收集的样品测试溶液和配制好的标准工作液同时置于离子色谱仪上，按仪器色谱分析条件进行测定。用硫氰酸根标准品的保留时间定性，峰面积定量，同时做空白试验。

1.3.4 结果计算

试样中硫氰酸根的含量以质量浓度X计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示，按下式计算：

式中：c为待测溶液从标曲上查得硫氰酸根的浓度（mg/L）；V1为样品用乙腈提取时定容体积（mL）；V2为移取离心后上清液的体积（mL）；V3为上清液稀释定容的体积（mL）；m为试样质量（g）。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

SCN-是疏水性和易极化的阴离子。采用可兼容梯度洗脱的高容量阴离子分离柱——Ion Pac AS 16型分析柱(4mm×250mm)，适用于易极化阴离子的分析，通过在固定相上键合强亲水性烷醇基季铵盐，增强对OH-的亲和力，使用中等浓度的OH-淋洗液，即可以快速分离易极化阴离子，而且峰型对称、尖锐。

2.2 淋洗液的选择

本研究选取KOH溶液作为淋洗液，淋洗液OH-由淋洗液自动发生器在线产生，只加水，不用化学试剂，操作简便，同时ASRS型抑制器可有效降低背景电导和提高分析物测定灵敏度。OH-作为淋洗液抑制反应产物是水，背景电导较小，通常小于2μS；同时可采用梯度淋洗，且运行梯度时基线较稳，水负峰小，可大体积进样。经优化，淋洗液为45mmol/L KOH，可在12min内完成硫氰酸根的洗脱出峰，且前后无明显干扰峰。

2.3 选择性试验

由于牛奶样品在前处理过程中经过乙腈沉淀蛋白、RP柱除去了疏水性有机物，因此样品溶液基质中可能对SCN-检测有干扰的是共存的阴离子，因此需要考察所选择的色谱柱与淋洗液是否能将SCN-与共存离子有效分离。本研究将F-、Br-、NO3-、NO2-、SO42-、PO43-这几种常见阴离子添加到SCN-标准溶液中进行分离分析，实验采用浓度45mmol/L氢氧化钾溶液作为淋洗液，1.0mL/min的流速进行分离，SCN-与其他可能共存的阴离子得到了较好的分离，共存离子对SCN-检测无干扰。7种阴离子色谱图见图1。

图1 硫氰酸根离子与6种常见阴离子混合标准溶液的离子色谱图

2.4 样品前处理条件优化

牛奶中含有大量的蛋白质和脂肪，因此提取过程中去除蛋白和脂肪是首要考虑的问题。蛋白去除不好，提取液很难用针头滤膜微孔过滤器过滤，且过滤后大分子杂质很多，这些成分与分离柱的填料发生作用，影响柱效和色谱柱的使用寿命。通过查阅文献结合实验经验，本研究选取乙腈作为提取剂，乙腈的蛋白沉降作用较好，提取液静置离心后澄清度好，易于后续过滤膜及过固相萃取柱的操作。由于前处理过程引入有机溶剂乙腈，而目前通常采用的自动循环抑制模式是利用废液作再生液，乙腈电解成离子形态进入淋洗液通道，会导致检测分析中基质信号值升高，待测物质峰形拖尾等问题，因而实验采用外加水模式，以避免这种现象。同时，通过将乙腈提取液稀释10倍的操作，将上机液中乙腈的含量减少至6%。另一方面，生乳中脂肪的含量也较高，而乙腈除脂肪的效果不太好，因此在离心时将温度设定到4℃，有利于脂肪的沉降，可以很明显地看到水、脂肪、乙腈的界面分层。

牛奶样品基质较为复杂，乙腈提取后直接取上清液上机，样品中杂质组分较多，随着进样次数增多柱效随之下降，直接表现就是待测物保留时间提前，分离度下降。本研究采用OnGuard II RP柱去除污染分离柱和干扰实验结果的有机物。RP柱是一种反相固相萃取柱，键合基团为含有一个微孔的二乙基苯，性能类似C18柱，主要用于去除疏水性大分子物质。取提取液1mL，用水稀释10倍后，过OnGuard II RP柱（使用前需用5mL甲醇+10mL水进行活化），调整流速在1mL/min左右，弃去前3mL样品流出液，收集滤液待测。经净化处理，样品中的脂肪、蛋白等有机残留物被吸附在OnGuard II RP柱上，而待测分析物在OnGuard II RP柱上基本没有保留，直接流出OnGuard II RP柱，样品净化效果良好。

2.5 标准溶液保存稳定性

表2 硫氰酸根标准工作溶液在0～4℃保存稳定性

离子色谱法检测硫氰酸根是外标法定量，因此标准溶液浓度是否稳定会直接影响结果。取浓度为0.01、0.02、0.05、0.10、0.50和1.00mg/L的硫氰酸根标准工作溶液，在0～4℃保存1d、30d、48d后分别测定分析，峰面积如表2所示。结果表明硫氰酸根标准工作溶液在0～4℃保存下稳定性较好，有效期大于一个月。

2.6 方法线性范围

配制7点不同浓度工作曲线：将硫氰酸根标准中间液（10mg/L）用水稀释，制得标准系列工作溶液，浓度为0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L，在本法所确定的试验条件下进样测定，得到硫氰酸根的峰面积。以硫氰酸根的浓度x（mg/L）为横坐标，硫氰酸根的峰面积y（μS＊min）为纵坐标，绘制标准曲线，在0.01～1.0mg/L范围内呈良好线性关系，回归方程y=0.7235x-0.0023，相关系数R2=0.9998，标准曲线见图2。

图2 硫氰酸根离子标准溶液的离子色谱图（A）和标准曲线（B）

2.7 方法检出限与定量限

在优化的测定条件下，离子色谱仪对硫氰酸根的检出限（S/N=3）为0.01mg/L，定量限（S/N=10）为0.03mg/L。在本研究过程中，组织了6家实验室对检出限进行验证。验证结果表明，6家实验室对浓度为0.01mg/L的硫氰酸根离子标准溶液测定的信噪比均大于3（表3和图3）。考虑到样品前处理过程中的稀释倍数为25倍，本试验在比对验证工作中，制备了生乳中添加最低浓度点为0.25mg/kg的加标样品，验证结果表明信噪比均大于10，且均具有较好的回收率。因此，本方法对牛奶中硫氰酸根的检出限为0.25mg/kg，定量限为0.75mg/kg。

图3 硫氰酸根离子标准溶液（0.01 mg/L）的离子色谱图（5次重复）

表3 不同实验室对硫氰酸根离子标准溶液检出限的验证结果

2.8 实验室内加标回收率和精密度

本方法的实验室内回收率和精密度试验，以生乳为样品基质，添加硫氰酸根0.25mg/kg、0.50mg/kg、1.50mg/kg和5.00mg/kg，每个浓度水平进行6次重复试验，测得硫氰酸根的回收率和精密度汇总于表4。回收率范围在84.6%～104.1%之间，相对标准偏差范围在1.2%～9.2%之间。

2.9 实验室间加标回收率和精密度

本方法分别在6家有资质的实验室进行比对验证实验，以验证其重复性与再现性。以生乳为样品基质，添加硫氰酸根0.25mg/kg、0.50mg/kg、1.50mg/kg和5.00mg/kg，每个浓度水平进行6次重复试验。测得硫氰酸根的回收率和精密度汇总于表5。回收率范围在93.7%～100.1%之间，相对标准偏差范围在4.5%～13.4%之间。通过比对6家单位的结果显示，本方法具有良好的重复性与再现性。

表4 生乳中硫氰酸根添加回收率及实验室内精密度试验结果

表5 生乳中硫氰酸根添加回收率及实验室间精密度试验结果

3 结论

本研究对生乳中硫氰酸根测定离子色谱法的色谱柱、选择性、前处理条件、线性范围、方法检出限与定量限、实验室内加标回收率与精密度、实验室间加标回收率与精密度方面进行了优化和考察。从试验结果可以看出该方法的检出限为0.25mg/kg，定量限为0.75mg/kg，实验室内回收率范围84.6%～104.1%，相对标准偏差范围1.2%～9.2%，实验室间回收率范围93.7%～100.1%，相对标准偏差范围4.5%～13.4%，该方法操作简便，检测结果准确、可靠。