血管生成素样蛋白2与高脂血症性急性胰腺炎的相关性研究

夏亚兰，王民开

（1.黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000；2.贵州医科大学第三附属医院，贵州 都匀 558000）

高脂血症是急性胰腺炎发病的重要原因之一，其病因复杂，可能与高脂血症直接损伤、微循环障碍、胰蛋白酶原激活等有关[1-2]。血管生成素样蛋白2（Angptl2）主要是在鼠肝脏特异性表达的分泌型蛋白质，参与调节脂类代谢及抑制脂蛋白酶的活性，进而升高血浆血脂水平[3]。目前，Angptl2基因高表达可能与冠心病、糖尿病、肾病、肿瘤血管形成等存在一定相关性，但尚无关于Angptl2基因与高脂血症性胰腺炎相关性的报道[4-5]。本研究通过建立相关动物模型，探讨Angptl2与高脂血症性急性胰腺炎的相关性，为该疾病开辟新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

试剂：戊巴比妥钠（湖北鸿运隆生物科技有限公司）、丙基硫氧嘧啶（上海麦克林生化科技有限公司）、牛磺胆酸钠（美国Sigma公司）、胆酸钠及胆固醇（上海宝曼生物科技有限公司）、吐温-80（天津市福晨化学试剂厂）、甲醛（国药集团化学试剂有限公司）、无水乙醇（上海弗霓生物科技有限公司）、Trizol试剂（Invitrogen公司）、T0901317（上海 selleck chem 公司）、淀粉酶试剂盒（南京建成生物有限公司）、Angptl2试剂盒（美国UCL公司）。

仪器：实时荧光PCR（ABI7300）、荧光倒置显微镜成像系统（奥林巴斯公司）、离心机（北京奥德公司）、移液器（德国Eppendorf公司）、低温冰箱（海尔集团）、恒温水浴箱（上海精宏公司）。

1.2 实验动物及分组

选取实验动物中心提供的180只清洁级SPrague-Dawley（SD）雄性大鼠，体质量 160～180 g，平均体质量（169.26±0.37）g。采用随机数字表法分为正常组（n=30）、高脂血症组（n=30）、高脂血症性急性胰腺炎组（n=30）、急性重症胰腺炎组（n=30）、药物高脂血症组（n=30）、药物高脂血症性急性胰腺炎组（n=30）。所有大鼠均喂养均衡饲料，每日补充或更换饲料、饮水及垫料等。

1.3 方法

1.3.1 模型制备 正常组：予以均衡饲料，术中仅翻动大鼠胰腺及十二指肠。高脂血症组：予以高脂饲料（77%均衡饲料+20%猪油+3%胆固醇），构建高脂血症模型，术中仅翻动大鼠胰腺及十二指肠。高脂血症性急性胰腺炎组：予以高脂饲料，头皮针逆行穿刺胰胆管注射5%牛磺胆酸钠溶液，构建高脂血症性急性胰腺炎模型。急性重症胰腺炎组：予以均衡饲料，急性重症胰腺炎模型构造与高脂血症性急性胰腺炎组类似。药物高脂血症组及药物高脂血症性急性胰腺炎组：相关模型制备如前所述，采用10 mg/kg肝X受体（LXR）激动剂T0901317灌胃，制备药物模型[6-7]。所有大鼠均喂养2周。

1.3.2 Angptl2 mRNA及其蛋白检测 用Trizol试剂提取大鼠肝脏组织总RNA，溶解于无Rnase的水中，取总RNA 2 μg，逆转录试剂盒合成cDNA。取10 μL逆转录产物进行PCR反应，用ΔΔCt值法，以GAPDH表达为内参照，观察定量Angptl2 mRNA的表达。Angptl2引物序列：上游：5'-CAAGATGATCTGCCTGCTGACT-3'；下游：5'-ATGTCCGTGGAGTGCCTGA-3'；参照GAPDH引物序列上游：5'-GCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'；下游：5'-GGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。模型建立6 h后，大鼠心脏穿刺采血5 mL，离心机离心15 min（3 000 r/min），得血清。采用美国Eh800型BioTek酶标仪测定450 nm处光密度值，然后参考标准曲线查出相对应的血清Angptl2水平。

1.3.3 病理切片 用10%福尔马林常规固定大鼠胰腺组织，石蜡包埋、切片。采用HE染色胰腺组织，光镜下观察胰腺组织情况。采用Grewal法[8]进行胰腺组织病理评分，具体如下：（1）水肿。0分：无水肿；1分：叶间隙轻度增宽；2分：叶间隙重度增宽；3分：腺泡间隙增宽；4分：细胞间隙增宽。（2）坏死。0分：无坏死；1分：坏死面积≤10%；2分：10%＜坏死面积≤20%；3分：20%＜坏死面积≤30%；4分：坏死面积＞30%。（3）炎症。高倍镜下，0.1分/个炎性细胞，若炎性细胞数≥30个，则计4分。（4）出血。0分：无出血；1分：出血。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件分析数据，采用F检验来计算Angptl2 mRNA、蛋白等计量资料平均值的差异程度，采用LSD-t检验进行组间比较，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组Angptl2 mRNA及其蛋白表达情况

高脂血症组及高脂血症性急性胰腺炎组Angptl2蛋白和Angptl2 mRNA水平均高于正常组及急性重症胰腺炎组，差异具有统计学意义（P<0.05）；药物高脂血症组及药物高脂血症性急性胰腺炎组Angptl2蛋白、Angptl2 mRNA均高于正常组、高脂血症组、高脂血症性急性胰腺炎组、急性重症胰腺炎组，差异具有统计学意义（P<0.05）；药物高脂血症组与药物高脂血症性急性胰腺炎组Angptl2 mRNA及Angptl2蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），见表 1。

表1 各组Angptl2 mRNA及其蛋白表达情况（±s）

表1 各组Angptl2 mRNA及其蛋白表达情况（±s）

注：与正常组相比，△P<0.05；与高脂血症组相比，*P<0.05；与高脂血症性急性胰腺炎组相比，#P<0.05；与急性重症胰腺炎组相比，&P<0.05

Angptl2 mRNA Angptl2蛋白（ng/mL）组别正常组高脂血症组高脂血症性急性胰腺炎组急性重症胰腺炎组药物高脂血症组药物高脂血症性急性胰腺炎组例数30 30 30 30 30 30△△1.51±0.31 2.08±0.17 2.57±0.29 1.85±0.24 5.62±0.53 5.48±0.57 717.20<0.01△*△*#△*#&△*#&△*△*#△*#&△*#&F P--28.31±12.32 40.15±18.51 49.52±21.37 30.85±14.50 61.85±26.60 60.85±23.57 15.70<0.01

2.2 各组血清总胆固醇、甘油三酯、淀粉酶水平比较

高脂血症组及高脂血症性急性胰腺炎组总胆固醇、甘油三酯、淀粉酶水平均高于正常组及急性重症胰腺炎组，差异具有统计学意义（P<0.05）；药物高脂血症组及药物高脂血症性急性胰腺炎组总胆固醇、甘油三酯水平均高于正常组、高脂血症组、高脂血症性急性胰腺炎组、急性重症胰腺炎组，差异具有统计学意义（P<0.05）；药物高脂血症组总胆固醇、甘油三酯水平高于药物高脂血症性急性胰腺炎组，差异具有统计学意义（P<0.05）；药物高脂血症组淀粉酶水平低于药物高脂血症性急性胰腺炎组，差异具有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 各组血清总胆固醇、甘油三酯、淀粉酶水平比较（±s）

表2 各组血清总胆固醇、甘油三酯、淀粉酶水平比较（±s）

注：与正常组相比，△P<0.05；与高脂血症组相比，*P<0.05；与高脂血症性急性胰腺炎组相比，#P<0.05；与急性重症胰腺炎组相比，&P<0.05；与药物高脂血症组相比，@P<0.05

甘油三酯（mmol/L） 淀粉酶（U/L）总胆固醇（mmol/L）组别正常组高脂血症组高脂血症性急性胰腺炎组急性重症胰腺炎组药物高脂血症组药物高脂血症性急性胰腺炎组例数30 30 30 30 30 30△△2.97±1.32 4.87±1.85 6.52±2.70 3.80±1.66 10.34±3.65 9.82±2.73 48.12<0.01△△*△*#△*#&△*#&@△*△*#△*#&△*#&@△*△*#△*#&△*&@F P--0.82±0.13 1.20±0.24 1.38±0.17 1.07±0.15 1.98±0.41 1.79±0.37 81.03<0.01 703.89±113.65 985.72±153.58 3 021.83±1 527.65 813.26±133.07 1 219.92±285.74 2 937.62±1 510.53 43.59<0.01

2.3 各组胰腺组织病理评分比较

高脂血症性急性胰腺炎组与药物高脂血症性急性胰腺炎组水肿、坏死、炎症、出血评分均高于正常组、高脂血症组、急性重症胰腺炎组、药物高脂血症组，差异具有统计学意义（P<0.05）；高脂血症性急性胰腺炎组与药物高脂血症性急性胰腺炎组水肿、坏死、炎症、出血评分差异无统计学意义（P>0.05），见表3。高脂血症性急性胰腺炎组可见炎性细胞浸润、出血、坏死表现；药物高脂血症性急性胰腺炎组较高脂血症性急性胰腺炎组更为严重，见图1。

3 讨论

3.1 高脂血症性急性胰腺炎发病原因

高脂血症是导致急性胰腺炎的主要病因之一，可加重急性重症胰腺炎病理损害。相关研究表明，大鼠胰腺灌注不同浓度甘油三酯，其淀粉酶水平均升高，且灌注浓度越高，淀粉酶水平越高[9-10]。本研究通过饲喂高脂饲料及头皮针逆行穿刺胰胆管注射5%牛磺胆酸钠溶液，构建高脂血症性急性胰腺炎模型，发现其淀粉酶水平高于正常组、高脂血症组、急性重症胰腺炎组及药物高脂血症组（P＜0.05），且水肿、坏死、炎症、出血评分也较高，镜下胰腺组织表现更为严重，与国内外研究类似。可能与胰脂肪酶将甘油三酯水解为游离的脂肪酸而氧化损伤腺泡细胞，促使胰酶释放，导致胰腺损害有关[11]。此外，游离脂肪酸分解产物可激活胰蛋白酶原，促使腺泡分解，更加加重胰腺损伤[12]。目前，关于高脂血症性急性胰腺炎的研究主要停留在临床研究，对于其发病相关基因研究报道甚少。

表3 各组胰腺组织病理评分比较（±s，分）

表3 各组胰腺组织病理评分比较（±s，分）

注：与正常组相比，△P<0.05；与高脂血症组相比，*P<0.05；与高脂血症性急性胰腺炎组相比，#P<0.05；与急性重症胰腺炎组相比，&P<0.05；与药物高脂血症组相比，@P<0.05

1.00±0.00 0.65±0.28 0 1.00±0.00 574.94<0.01组别正常组高脂血症组高脂血症性急性胰腺炎组急性重症胰腺炎组药物高脂血症组药物高脂血症性急性胰腺炎组坏死出血例数30 30 30 30 30 30△水肿0.41±0.52 0.85±0.44 3.83±0.47 2.81±0.83 0.95±0.42 3.38±1.15 136.02<0.01 0 0△0 0△*△*#△*#&△*&@△*△*#3.65±0.53 2.27±0.42 0 3.77±1.30 285.66<0.01△*△*#△*&@△*△*#△*#&△*&@△*&@F P--炎症0.21±0.25 0.51±0.37 3.47±0.81 2.45±0.92 0.65±0.32 3.44±0.83 164.82<0.01

图1 胰腺组织HE染色（×400）

3.2 Angptl2升高高脂血症性急性胰腺炎血脂水平

Angptl2可调节体内脂代谢及促进血管生成，可升高大鼠血脂水平及抑制脂肪酶活性[13]。相关研究表明，Angptl2高表达与冠心病、冠状动脉粥样硬化、肾病、糖尿病等存在一定相关性。本研究发现，高脂血症性急性胰腺炎组Angptl2蛋白及Angptl2 mRNA水平均高于正常组、高脂血症组、急性重症胰腺炎组（P＜0.05），血清总胆固醇及甘油三酯水平均较高，表明Angptl2可升高高脂血症性急性胰腺炎的血脂水平，可能与其具有一定相关性。

3.3 LXR激动剂T0901317上调Angptl2水平

本研究进一步每天用10 mg/kg LXR激动剂T0901317给大鼠灌胃，一周后构建药物高脂血症模型及药物高脂血症性急性胰腺炎模型，发现两种模型的Angptl2蛋白、Angptl2 mRNA、总胆固醇、甘油三酯水平均高于其他4组（P＜0.05），可能是LXR激动剂T0901317可聚集大鼠肝脏及血浆中的甘油三酯，加速胆固醇的逆转运，诱导Angptl2 mRNA表达，导致上述指标水平升高[14-15]。另外，药物高脂血症性急性胰腺炎组与高脂血症性急性胰腺炎组淀粉酶水平及胰腺组织病理评分无明显差异（P＞0.05），但镜下发现药物高脂血症性急性胰腺炎组炎性细胞浸润、出血、坏死表现更为严重，表明Angptl2可能参与了高脂血症性急性胰腺炎的发生发展，且LXR激动剂T0901317可能上调大鼠Angptl2水平，导致胰腺组织损害更加明显。

综上所述，Angptl2与高脂血症性急性胰腺炎存在一定的相关性，LXR激动剂T0901317可上调高脂血症性急性胰腺炎大鼠Angptl2水平，加剧胰腺损伤。