基于HPLC法对加入厚朴后广藿香水溶性物质的含量影响研究*

齐乐辉，李嘉欣，孟 鑫，田 园，许树军

（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040）

广藿香为唇形科广藿香Pogostemon cablin（Blanco）benth.的干燥地上部分，主治、脘痞呕吐、暑湿表证等，厚朴为木兰科厚朴Magnolia officinalis Rehd.et Wils.及凹叶厚朴Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.的干燥外皮或根皮,具有行气消积、燥湿平喘功效[1]。藿香的药理作用主要有调节胃肠道功能、抗菌、镇痛等[2,3]。现代研究中，大多数将广藿香的挥发油类成分作为评价广藿香的指标，其挥发油有广藿香醇和广藿香酮等[4,5]。其挥发性成分具有抗菌、调节胃肠运动等功效[6,7]。广藿香抗菌实验也表明，广藿香的水提物及挥发性成分均具有抗菌作用[8]。目前，对广藿香与厚朴配伍的研究较少，关于广藿香与厚朴配伍后，厚朴对广藿香水溶性成分的影响几乎无文献报道，极有必要进行进一步的研究，完善研究广藿香水提物的物质基础，本研究采用HPLC测定广藿香与厚朴配伍前后水提物中香草酸、原儿茶酸的含量[9,10]，为深入研究广藿香的水溶性成分提供基础。

1 实验部分

1.1 材料及仪器

LT502型电子天平（常熟市天量仪器有限责任公司）；KQ-500DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HR-20 1000g多功能粉碎机（上海哈瑞斯电器有限公司）；Ultimate 3000超快速液相色谱仪（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）。

广藿香药材产于广东肇庆；姜厚朴产于浙江；香草酸和原儿茶酸对照品购买于上海源叶生物科技有限公司；甲醇（色谱纯）购买于天津星马克科技发展有限公司；乙腈（色谱纯）、磷酸（色谱纯）购买于天津科密欧化学试剂有限公司；纯净水为娃哈哈集团生产。

1.2 供试品溶液的制备

精密称取广藿香2.5g两份、厚朴2.5g。将广藿香、广藿香与厚朴1∶1配伍后分别置于圆底烧瓶中，加100mL蒸馏水，回流3次，每次30min，合并滤液，将滤液蒸干，残渣甲醇溶解至10mL容量瓶作为供试品溶液。

1.3 对照品溶液的制备

精密称取香草酸酸0.0039g、原儿茶酸对照品0.0036g，用适量甲醇（色谱纯）进行溶解定容至10mL容量瓶，制成原儿茶酸和香草酸溶液浓度分别为0.39、0.36mg·mL-1储备液。吸取上述两种对照品溶液各0.5mL成为混合对照品溶液，混合对照品溶液中香草酸浓度和原儿茶酸浓度分别0.195mg·mL-1，0.180mg·mL-1。

1.4 色谱条件

Ultimate 3000 HPLC仪器，Supersil ODS2（150mm×4.6mm，5μm）色谱柱，柱温：30℃，流速：1.0mL·min-1，进样量：10μL，流动相：乙腈-水（含 0.1%H3PO4），0～10min，10%～25%乙腈，检测波长：254nm。

1.5 线性关系的考察

1.5.1 线性及相关系数 混合对照品过0.45μm微孔滤膜置于样品瓶中，分别精密吸取 0.5 、3、5、7、9、11、13μL进高效液相检测。测定两种对照品溶液的峰面积，以峰面积（mAu·min）为 Y 轴，进样量（L）为X轴作标准曲线，得到两种成分的回归方程，测定线性。

1.5.2 重复性考察 精密称取广藿香-厚朴各2.5g，进行6次平行实验。按“1.4”项下检测，过0.45μm微孔滤膜，记录对照品峰面积RSD值。

1.5.3 含量测定 供试品溶液过0.45μm微孔滤膜，进行测定，记录峰面积，从而测得广藿香中两种水溶性成分（香草酸，原儿茶酸）的含量。

2 结果与讨论

2.1 共有峰确认

将两种对照品溶液、对照混合溶液分别按“1.4”项下色谱条件进行检测，分别确定对照品保留时间。如图1所示，峰形较好，保留时间一致。

图1 共有峰的确认的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of confirmed peaks

2.2 线性关系考察

以混合对照品进样量为横坐标X（μL），峰面积为纵坐标Y。得原儿茶酸回归方程为y=7.895x+4.5154，R2=0.9998。得香草酸峰回归方程为y=7.6977x+1.7205，R2=0.9997，线性良好。

图2 原儿茶酸标准曲线Fig.2 Standard curve of primary catechin

图3 香草酸标准曲线Fig.3 Standard curve of vanilla acid

2.3 重复性考察

广藿香重复性实验中香草酸峰面积RSD值为2.37%，原儿茶酸峰面积RSD值为1.09%。二者均符合标准，证明重复性良好，见图4。

图4 广藿香重复性考察的HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatogram for repeatability of patchouli

广藿香与厚朴配伍重复性实验中，香草酸的RSD值为2.79%，原儿茶酸RSD值为2.87%。二者均符合标准，证明重复性良好。

图5 广藿香厚朴配伍后的重复性考察的HPLC色谱图Fig.5 HPLC chromatogram of repeatability of patchouli after compatibility

2.4 含量测定

按上述方法进行广藿香加热回流后的供试品测定，得色谱图见图6和峰面积见表1。

表1 广藿香含量测定Tab.1 Determination of Patchouli

实验测得广藿香中原儿茶酸的含量为0.001572mg·g-1，香草酸含量为 0.000485mg·g-1。

图6 广藿香含量测定HPLC色谱图Fig.6 Determination of patchoulicontentby HPLC

按上述方法进行广藿香与厚朴1∶1配伍后加热回流后的供试品测定，得色谱图见图7、峰面积见表2。

图7 广藿香与厚朴配伍后的含量测定HPLC色谱图Fig.7 Determination of content of patchouli and magnolia after compatibility HPLC chromatogram

表2 广藿香与厚朴配伍后的含量测定Tab.2 Determination of the contentsof patchouli and magnolia after compatibility

实验测得广藿香加入厚朴后原儿茶酸的含量为0.002475mg·g-1，香草酸含量为 0.007693mg·g-1。

3 结论

线性、精密度、重复性实验均符合标准，证明该方法可以准确测定。广藿香与厚朴进行1∶1配伍后，原儿茶酸含量约是配伍前的1.6倍；广藿香与厚朴1∶1配伍后对香草酸含量影响较大，广藿香与厚朴1∶1配伍后香草酸含量约是配伍前的15.9倍。