离子型金属荧光试剂法测定花类中药的抗氧化活性研究*

郭新颖，陈 峰，杨清华，杨梅桂，戴志英

（江苏省南通市疾病预防控制中心 理化科，江苏 南通 226007）

花类中药（traditional Chinese medicine flowers,TCM flowers）是一类以植物花入药的中草药材料的总称，药用的花用部位一般为干燥的单花、花序以及花的某一部分。大量的研究证明，许多花类中药提取物具有良好的养生保健与临床应用，能够有效缓解血脂紊乱、糖尿病、高血糖和炎性疾病[1]，一些常见的花类中药普遍成为人们茶余饭后就地取材的日常营养保健品。羟自由基（·OH）作为一类普遍参与人体代谢活动的活性氧自由基，需要外界和体内提供大量抗氧化剂进行清除。基于此，花类中药的抗氧化活性性能研究逐渐成为许多学者的研究热点[2,3]。本试验通过一种新型锰基芬顿试剂荧光分析法对6种花类中药进行抗·OH的体外抗氧化研究并比较了抗氧化活性大小，可为花类中药在抗氧化性能筛选、医疗保健和临床开发及应用等方面奠定一定的理论基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

M-850型荧光分光光度计（日本日立公司）；FA2004型电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）。

2.0 ×10-4mol·L-1罗丹明B溶液，1.5×10-4mol·L-1MnSO4溶液，0.3%H2O2溶液，0.05mol·L-1Tris-HCl缓冲液。试验用花类中药均为市售，所用试剂均为分析纯，实验用水为二次去离子水。

1.2 试验方法

在两支10mL比色管中分别依次加入0.8mL RB溶液，1.0mL Tris-HCl缓冲液，一支作为空白参比，另一支加入0.6mL MnSO4溶液和0.4mL H2O2溶液。定容摇匀，常温放置10min，用1cm的荧光比色皿在582nm处分别测定空白参比的荧光强度F0和反应体系的荧光强度F。其中，·OH清除率计算公式为[4]：

C%=（Fs－F）/（F0－F）×100%

1.3 原料处理

将干性样品充分研磨，准确称取5.00g，置于杯中，加入沸水浸泡得到初提液，再用沸水反复冲洗残渣，合并滤液，冷却、过滤、离心，定容至500mL，取上清液待测。

2 结果与讨论

2.1 测定原理

本试验是在传统Fenton反应的基础上将铁基芬顿试剂换为锰基芬顿试剂进行类芬顿反应。锰与铁元素在第四周期，同属过渡金属，化学性质极为相似。由此建立了一种新型锰基类Fenton试剂反应，用于测定花类中药的抗·OH清除率，从而评价不同花类中药提取物的抗氧化活性。

2.2 荧光光谱

RB作为一种常用荧光染色剂，本身具有很强的荧光。在弱碱性介质中，用M-850型荧光光度计对体系溶液的荧光强度进行测定，得到了空白参比溶液、不含抗氧化剂溶液和含有抗氧化剂溶液的3种不同反应体系的荧光光谱图。试验发现，锰基芬顿（Mn-Fenton）体系溶液的发射波长为582nm，仅仅加入Fe2+-H2O2溶液时，体系的荧光强度几乎无变化；当加入Fenton试剂，体系发生荧光淬灭，荧光强度显著下降；当加入抗氧化剂，即发生抗氧化剂清除·OH反应时，可使荧光淬灭程度减弱。

2.3 最佳试验条件

分别对体系中的缓冲液用量、荧光剂用量、锰试剂用量、H2O2用量和反应时间进行试验，探索出荧光光谱法的最佳试验条件。

2.3.1 缓冲液用量的影响 由于·OH的产生与pH值有关，试验中发现在碱性条件下锰基类Fenton体系荧光淬灭程度提高，△F值大，抗·OH的清除率表现出优异的性能，但是过强的碱性环境容易使体系不稳定。因此，综合考虑，试验选用pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液1.0mL进行试验，此时锰基类Fenton体系稳定、反应快速、荧光淬灭程度高。

2.3.2 荧光剂用量的影响 在RB荧光试剂体积为0.1～1.2mL的范围内进行试验，发现随着荧光剂RB体积用量的不断增加，△F值不断增大，但用量过大体系超出可视读数范围，因此，综合考虑，本试验选用浓度为2.0×10-4mol·L-1的RB溶液0.8mL。

2.3.3 锰试剂用量的影响 在锰基反应试剂体积为0.1～1.0mL的范围内进行试验，发现反应体系的荧光强度随着Mn2+浓度的增加而呈现出下降趋势，△F值缓慢增大；当Mn2+浓度达到0.6mL时，△F值基本无变化，故本试验选择1.5×10-4mol·L-1的MnSO4溶液0.6mL。

2.3.4 H2O2用量的影响 体系的H2O2浓度在一定程度上决定了体系的反应速率和抗氧化清除率，本试验选用0.3%的H2O2溶液0.4mL，此时，△F值较为理想。

2.3.5 反应时间的影响 在0～20min以内对反应体系的荧光强度进行测定，发现在10min内，体系的荧光强度呈现出先急剧降低后趋于平缓的下降趋势，10min以后△F值变化缓慢，清除率趋于稳定，说明本法的稳定性较好，试验时将反应时间调整为10min。

2.4 样品的抗氧化活性

为测定花类中药样品的清除率，按上述测定方法对6种花类中药水提物进行·OH清除率的测定，结果见表1。

表1 不同花类中药对·OH清除效果的比较（n=6）Tab.1 Comparion of·OH scavenging effect of different TCM flowers

从表1中可以看出，玫瑰花对·OH的清除率相对最高，数值达到54.31%，表明其抗氧化活性最强；三七花的清除效果最弱，清除率仅达16.35%。综合来看，6种花类中药水提物清除率范围在16.35%～54.31%，总体抗氧化活性顺序为玫瑰花＞栀子花＞槐花＞葛花＞桂花＞三七花。不同花类中药的抗氧化性能或可与其各自抗氧化活性成分及其含量大小有关。总之，试验结果为日常选择具有良好食用价值和保健功能的花类中药提供了一定的参考价值。

3 结论

荧光光谱法具有准确快速、操作简便等优点，是实验室普遍使用的一种分析方法。本试验是在传统芬顿试剂反应的基础上建立一种新型锰基类芬顿试剂荧光法对6种花类中药进行抗·OH的体外抗氧化研究，并比较了其抗氧化性能。研究结果表明，6种花类中药的抗氧化能力大小各有差异，与其他文献略有不同，这或可是由于试验本身的测试方法和反应条件不同，抑或由于样品的加工工艺的差异导致其在抗氧化性能与清除率数值上有所差别。但6种花类中药的自由基清除能力各自表现出了较好的抗氧化性能，这与其各自本身的抗氧化活性成分、含量与抗氧化基团密不可分[5-7]。总之，本试验研究结果为花类中药在食品开发和医药保健领域的功能性开发提供了理论支持。当然，对于花类中药的抗氧化成分的提取及其含量的分析研究，依旧是本课题组今后的研究重点，仍然有待于进一步深化探讨。