利用生物信息学分析花椒改善心血管系统功能的分子机理

高宁，刘博，王博，南洋，程玉鹏

(1.黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江农垦职业学院，黑龙江 哈尔滨 150025)

花椒在我国应用历史悠久，是典型的药食同源植物，其不仅是日常生活中最为常见的调味品，同时也是祖国医药宝库中重要的传统中药。花椒属植物在世界范围内共约250种，我国分布有45种[1]。我国花椒种植历史悠久，分布广泛，四川汉源、陕西韩城、凤县、山西芮城、重庆江津等地均为我国花椒的重要产区。近年来，随着市场需求的增加，我国花椒产业不断发展，种植规模持续扩大，花椒的风味物质分析[2]、良种选育[3]、采收加工[4]、质量鉴定[5]等方面的研究也取得了诸多成果。然而，目前花椒主要是作为调味品直接食用，其深加工产业尚处于起步阶段，同时其药用价值的开发也缺少深入的作用机理研究。2015版《中国药典》记载花椒性温，味辛，归脾、胃、肾经，具有温中止痛，杀虫止痒的功效。药典所载其用药部位为芸香科植物青椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb.et Zucc.)或花椒(ZantohxylumbungeanumMaxin.)的干燥成熟果皮[6]。研究表明，花椒含有挥发油类、生物碱类、香豆素类等多种成分，对心血管系统疾病、消化系统疾病、免疫系统疾病等均有较好疗效[7]。特别是对心血管系统，现代药理学研究发现，花椒能够扩张血管、降压降脂、预防血栓、保护心肌，具有良好的应用开发前景[8]。现阶段花椒药用价值的研究多集中于特定药效的确认，其改善心血管系统功能的分子机制尚不清晰。

基因芯片技术基于分子杂交原理，利用芯片上固定的核酸探针能够一次性检测几万个基因的表达量变化，是转录组研究的重要手段之一。利用基因芯片技术结合生物信息学分析手段，能够快速有效的筛选出差异基因所涉及的生物学功能及参与的信号途径，在疾病检测[9]、发病机理研究[10]、中药作用机制研究[11]等方面发挥了重要作用。因此，本研究利用基因芯片技术检测了大鼠灌胃花椒前后基因表达差异，并采用生物信息学手段分析其对心血管系统的调控机理，为深入开发花椒的药用价值提供试验参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 试验材料

试验用花椒购自哈尔滨世一堂药店，经黑龙江中医药大学中药资源与开发教研室王振月教授鉴定符合2015版《中华人民共和国药典》相关规定。

花椒水煎液的制备：取花椒称重，加入10倍量蒸馏水浸泡1 h，加热，微沸煎煮1 h，过滤得药液，滤渣加入8倍量蒸馏水，重新煎煮1 h，过滤，合并2次药液，浓缩成终浓度为0.2 g·mL-1生药量的花椒水煎液。

基因芯片采用美国Agilent公司Agilent Rat Gene Expression(8*60 K)大鼠基因芯片(Agilent，Design ID：028279)。

1.1.2 试验仪器

美国Agilent G2 545 A杂交炉；美国AgilentG2050C芯片扫描仪；美国Thermo NanoDrop核酸分析仪；美国Bio-Rad T100 PCR仪；德国Eppendorf 5418R低温离心机，德国Eppendorf ThermoMixer C恒温混匀仪。

1.1.3 实验动物

雄性SPF级SD大鼠，体重160～200 g，购自黑龙江中医药大学医学实验动物中心，合格证号：SCXK黑2017004。动物日常护理及试验条件均符合《中华人民共和国卫生部实验动物环境及设施标准》。

1.2 试验方法

1.2.1 实验动物给药与组织样品处理

将SD大鼠随机分为空白组与花椒给药组，每组10只，共计20只。采用灌胃给药方式每天上午对花椒给药组大鼠喂食花椒水煎液，最终给药量为8.4 g·kg-1(生药量/体重)，空白组灌胃同体积生理盐水，连续给药21 d，自由进食饮水。给药结束后，处死大鼠，迅速取出肝脏并浸入液氮冷冻，取部分肝组织用于总RNA的提取，其它部分置于-80 ℃保存。

切取部分大鼠肝脏放入液氮并研磨，采用mirVanaTM RNA Isolation Kit试剂盒(Applied Biosystems公司)提取大鼠肝脏总RNA，得到空白组大鼠肝脏总RNA与花椒给药组大鼠肝脏总RNA。利用核酸分析仪检测各组RNA浓度并进行定量，并利用Agilent Bioanalyzer 2100检测RNA完整性。(要求：核酸分析仪检测A260/A280在1.9～2.2之间，且Agilent Bioanalyzer 2100检测28S/18S值大于0.7、2100RIN值大于7.0，视为合格。)

1.2.2 基因表达检测与差异基因筛选

经检验合格的RNA进一步纯化后逆转录形成双链cDNA，随后合成Cyanine-3-CTP标记的cRNA并与基因芯片杂交，洗脱后得到基因芯片杂交信号图像，运用Feature Extraction提取原始数据，随后利用Genespring对原始杂交信号进行归一化处理，比较花椒给药组与空白组基因表达信号，以上调或下调2倍作为阈值，筛选差异基因。

1.2.3 生物信息学分析

将差异基因上传至生物信息数据分析平台IPA(Ingenuity Pathway Analysis，http://www.ingenuity.com)，以心血管系统功能为焦点，利用IPA分析差异基因的生物功能(Bio-function模块)及其参与的信号通路(Canonical Pathway模块)，从转录组水平探讨花椒改善心血管系统功能的分子机理。

1.3 统计分析

生物信息分析结果采用Fisher精确检验(Fisher's exact test)分析，统计显著性设定为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 RNA提取与差异基因筛选结果

采用核酸分析仪通过A260/A280的值检测各组总RNA的纯度并对提取得到的总RNA进行定量，结果表明，各组总RNA样品的A260/A280均在1.9～2.2之间，说明总RNA纯度良好，Agilent Bioanalyzer 2100检测结果表明28S/18S均大于0.7，2100RIN值均大于7.0，检测图谱清晰，无拖尾现象，表明总RNA完整无降解(图1，表1)。基因芯片杂交扫面图像斑点清晰、密度均匀，原始数据经处理后，以2倍作为阈值，利用FoldChange进行差异基因筛选，结果表明，花椒给药组与空白组相比较，共有1 429条基因发生表达量变化，其中表达量上调的基因有791条，而表达量下调的基因共有638条(图2)。

2.2 生物信息学分析结果

2.2.1 花椒调节的心血管系统功能

将差异基因导入IPA在线分析数据库，通过Bio function模块分析发现，花椒给药组与空白组比较所得差异基因中涉及心血管系统功能的基因共有111条，聚类于37个生物功能中，涉及多种心血管系统疾病，如高血压、血栓形成、心绞痛、心律失常等，与已有研究报道相吻合[12]。心血管系统相关的富集显著性前10位的生物功能如表2。

A.各样品总RNA经Agilent Bioanalyzer 2100检测所得电泳图；B.各样品总RNA经Agilent检测所得峰值图。其中：Ladder代表标准分子量Marker；GN0代表空白组，GN6代表花椒给药组

表2 花椒给药组差异基因富集显著性前10位的心血管相关Bio Function

Table 2 Top 10 enrichment of cardiovascular system related Bio Function

2.2.2 花椒影响的心血管系统相关信号通路

将差异基因导入IPA在线分析数据库，利用Canonical Pathway模块分析花椒对大鼠代谢及信号通路的调节作用。结果发现，共有32条信号途径得到富集，其中与心血管系统功能密切相关的信号通路有7条，其中上调的通路包括心血管系统中的NO信号(Nitric Oxide Signaling in the Cardiovascular System)、多巴胺受体信号(Dopamine Receptor Signaling)、促肾上腺皮质激素释放激素信号(Corticotropin Releasing Hormone Signaling)和β肾上腺素能信号(Cardiac β-adrenergic Signaling)；下调的通路包括内皮素-1信号(Endothein-1 Signaling)与血管内皮生长因子家族配体受体相互作用(VEGF Family Ligand-receptor Interactions)；而心脏发生促进因子(Factors Promoting Cardiogenesis in Vertebrates)的调节趋势不明显(图3)。

3 讨论

花椒是典型的药食同源性调味品，具有广泛的应用范围，在人们日常饮食与临床用药中均具有重要作用，特别是对心血管系统疾病表现出良好的治疗效果。本研究利用生物信息学手段分析了花椒给药组与空白组大鼠间的差异基因，对其涉及的生物学功能及信号途径进行了富集分析，探讨其改善心血管系统的分子机制。结果表明，共筛选得到111条与心血管系统相关差异基因，共富集于高血压、血栓形成、心绞痛等37个生物学功能，信号通路分析则表明，内皮素-1信号等信号通路在花椒治疗心血管系统疾病过程中可能发挥重要作用。

内皮素(endothein，ET)家族共包含3种多肽，ET-1、ET-2与ET-3，其中ET-1是主要活性物质，是维持血管张力的重要物质[13]。内皮细胞生成的大部分ET-1通过血管壁的基底侧扩散并与平滑肌细胞上的捏皮素受体结合，最终导致血管收缩。研究表明，内皮素能够调节蛋白激酶C(PKC)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K/Akt)等多种信号途径，影响机体心血管功能。体内ET-1浓度的增加能够强烈的提升血压，ET-1还能够促进血管肥大并诱发局部炎症，同时，ET-1及其信号调控还与肺动脉高压、心肌梗塞、动脉粥样硬化等病理过程密切相关[14]。通路分析结果发现，花椒抑制内皮素-1信号(Endothein-1 Signaling)，这可能是其降血压、保护心肌等作用的分子机制(图3-B)。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是生物体重要的信号分子，主要由一氧化氮合酶催化产生，其在体内能够激活鸟苷酸环化酶，产生cGMP，后者能够激活一系列的蛋白磷酸化过程，发挥信号转导与调节作用，调控多种生理生化反应。现代药理学研究表明，NO通路对于维持血压稳定、预防血栓、缓解血管内皮损伤等均有重要作用，高血压、动脉粥样硬化、冠心病等的发病均与NO信号途径呈负相关[15]。通路分析结果发现，花椒能够促进心血管系统中的NO信号(Nitric Oxide Signaling in the Cardiovascular System)，这可能是花椒降压降脂、保护心肌、预防血栓的分子机制之一(图3-C)。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一类同源二聚体糖蛋白，其主要生理功能表现为促进血管生成、增加血管通透性以及影响血流动力学。目前人体VEGF家族共发现VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、以及胎盘生长因子(PGF)5类成员；其受体属酪氨酸激酶受体，包括VEGFR-1、VEGFR-2与VEGFR-3。现有研究报道显示，VEGF表达量与深静脉血栓形成、自发性高血压、动脉粥样硬化等均呈正相关[16]。通路分析结果发现，花椒能够抑制血管内皮生长因子家族配体受体相互作用(VEGF Family Ligand-receptor Interactions)，这可能部分解释花椒降压降脂、预防血栓的药理作用(图3-D)。

此外，通路分析表明花椒能够促进多巴胺受体信号(Dopamine Receptor Signaling)，而相应的多巴胺受体能够通过调节内皮细胞、平滑肌细胞活性达到防治动脉粥样硬化的作用[17]，这也与花椒降血脂、预防动脉粥样硬化的报道吻合[18](图3-E)。

A.心血管系统相关信号通路富集结果；B.内皮素-1信号；C.心血管系统中的NO信号；D.VEGF家族配体受体相互作用；E.多巴胺受体信号

4 结论

综上可知，花椒能够调控与高血压、血栓、心绞痛、心律失常等疾病相关的基因表达，其能够通过抑制内皮素-1信号与血管内皮生长因子信号、促进NO信号与多巴胺受体信号来发挥治疗心血管系统疾病的药效作用，研究结果为深入了解花椒调控心血管系统的分子机理提供了理论基础与试验参考。