温度对辽东栎光系统Ⅱ的影响

周帅，郝向春，韩丽君，翟瑜，陈思

(山西省林业科学研究院，山西 太原 030012)

温度对植物光合机构的运行具有重要影响，光系统II(photosystem II；PSII)是对温度胁迫最敏感的组分[1]，往往能决定整个光合系统的运行效率。利用非损伤、检测时间短、灵敏度高的快速叶绿素荧光诱导动力学技术[2]，可以准确地研究温度与PSII光化学活性之间的关系[3～6]。辽东栎Quercusliaotungensis为壳斗科Fagaceae栎属Quercus落叶乔木，是暖温带落叶阔叶林的重要树种，也是华北中低山地带营造针阔混交林的良好混交树种[7，8]。辽东栎林的天然更新以萌蘖为主，但存在严重的生长退化现象，其土壤种子库也由于萌发、被捕食、虫蛀和生理死亡等原因而过早丧失[9，10]，使得人工育苗成为促进种群更新和营建针阔叶混交林的首选措施。目前，辽东栎育苗的研究主要从苗期生长规律[11，12]、土壤[13，14]、温度[15]、光照[16，17]、水分[15, 18]、动物取食[19，20]和种间竞争[21]等方面开展，针对辽东栎幼苗的适宜培养温度的研究还较为匮乏。

在区域尺度上，研究物种分布与气候的关系，可以确定对物种有显著影响的主要环境因子的阈值，这种方法在蒙古栎Quercusmongolica、乌冈栎Quercusphillyraeodies和辽东栎等栎属植物中已有应用[22～24]，但现有研究均未对辽东栎生境的最热月份最高温数据进行统计分析。

本研究一方面在单株尺度，以PSII光化学活性为研究切入点，采用连续测定与控制试验的方法，观测不同环境温度下1年生辽东栎苗叶片的相对叶绿素含量(relative chlorophyll content；SPAD)，快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线)特征，以及快速叶绿素荧光诱导动力学测量(JIP-test)参数的变化，尝试建立叶片性能指数(PIABS)的温度响应模型，计算PSII光化学活性的最适温度；另一方面从区域尺度，利用辽东栎地理分布点的最热月份最高温数据，对单株尺度得出的PSII光化学活性的最适温度进行比较检验，以期探究辽东栎PSII光化学活性与环境温度之间的关系，初步明确辽东栎幼苗的适宜培养温度，为辽东栎工厂化育苗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理方法

供试材料为1年生辽东栎容器苗(山西省林业科学研究院阳曲试验基地培育)，株高15±3 cm，地径3.8±0.4 mm。于2018年8月，选取长势良好，无病虫害，大小相近的辽东栎12盆，置于人工气候箱中适应培养3 d，人工气候箱参数为：温度25 ℃；昼夜相隔时间12 h；光照强度500 μmol·m-2·s-1；相对湿度60%±3%，根据表土干燥情况适量浇水。升温处理：设置25、35、45 ℃等3个测试温度，从25 ℃依次升至35和45 ℃；降温处理：设置25、15、5 ℃等3个测试温度，从25 ℃依次降至15和5 ℃。温度变化速率为2 ℃·h-1，每个测试温度的处理时间为24 h，升降温各处理6盆辽东栎。

每个测试温度处理时间完成后，对植株进行暗适应20 min，然后进行快速叶绿素荧光诱导动力学测量，随后进行SPAD测量。同一株上的2项测量均在同一片健康、成熟的叶片上进行，测量位置相互错开。每个处理6盆，每盆选5个叶片测定，每盆作为1个独立重复试验。以25 ℃的温度处理为对照(CK)。上午10：00测定各项指标。

1.2 单株指标测定方法

1.2.1SPAD测定

采用叶绿素测定仪(SPAD-502Plus，KONICA MINOLTA，日本)测定各温度处理植株的SPAD。

1.2.2 快速叶绿素荧光诱导动力学测量

快速叶绿素荧光诱导动力学测量采用叶绿素荧光仪(Yaxin-116G，雅欣理仪公司，中国)，测定前暗适应20 min，选取叶肉部分用3 000 μmol·m-2·s-1饱和蓝闪光照射1 s，以10 μs(300 μs之前)、100 μs(300 μs～3 ms之间)和1 ms(3 ms之后)的间隔记录荧光信号，并计算叶绿素荧光动力学参数。暗适应后照光150 μs、300 μs时的相对荧光强度VL和VK、PSII单位面积反应中心数量RC/CSO、单位反应中心吸收的能量ABS/RC、单位反应中心以热能形式耗散的能量DI0/RC、单位反应中心捕获的用于还原QA的能量TR0/RC、单位反应中心用于将电子从QA-传递到PQ的能量ET0/RC、单位反应中心用于将电子从QA-传递到PSI的能量RE0/RC、PSII光化学初级最大效率φP0(可供还原的QA的量)、PSII捕获的电子从QA-传递到PQ的效率ψE0、电子从PQH2传递到PSI最终受体侧的效率δR0、叶片性能指数PIABS等参数计算参照李朋民等[25]和Tsimilli[26]。

1.3 区域指标计算方法

辽东栎分布点信息来源于中国数字植物标本馆(CVH，http://www.cvh.org.cn/)和全球生物多样性信息网络(GBIF，https://www.gbif.org/)，同时结合中国植物志在线版(http://frps.iplant.cn/)所述的辽东栎分布范围，对数据进行初筛。然后对能涵盖所有分布点的研究区域栅格化(栅格规格为0.5°经度×0.5°纬度)，在每个栅格内只保留1个分布点，完成数据终筛。之后再利用分布点的经纬度从 WorldClim 数据库(www.worldclim.org)中提取最热月份最高温，分辨率为 5 arc-minites。最后，计算最热月份最高温数据的平均值和95%置信区间。

1.4 数据处理

数据统计分析采用SPSS 22，应用最小显著差数法(LSD)进行多重比较，回归分析和绘图采用Origin2018，分布地点收集和气象数据提取采用R。

2 结果与分析

2.1 温度降低对SPAD的影响

由图1可见，与25 ℃相比，SPAD在15 ℃时无显著变化，5 ℃时显著下降到25 ℃的85.4%，表明5 ℃的环境温度会导致辽东栎叶片叶绿素含量显著降低。35 ℃时SPAD达到最高值78.9，45 ℃时显著降低到35 ℃的92.6%，但35 ℃和45 ℃的SPAD均比25 ℃时显著高出31.1%和21.4%(图1)，表明35 ℃的环境温度有利于叶绿素含量增加，但45 ℃时叶绿素含量显著降低。

不同字母表示在P<0.05水平上差异显著，下同

2.2 温度对快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的影响

各温度的OJIP曲线均可以观察到O、J、I、P各相，但5、15、45 ℃的O相上升、P相降低，表明这3个温度下的电子传递链运转受阻(图2A)。将标准化的各处理曲线与25 ℃相减，可见5 ℃的J相和45 ℃的I相最明显，表明低温5 ℃造成QA-的过量积累，高温45 ℃导致电子从QA-向QB传递过程出现异常(图2B、C)。45 ℃时出现了明显的K点和L点，表明PSII供体侧和PSII反应中心受损(图2D、E)。此外，35、15、5 ℃也观察到K点，但不明显(图2D)。

A，不同温度处理的辽东栎叶片OJIP曲线(6次重复的平均值)；B，标准化的OJIP曲线，VO-P表示Fo与Fm间相对可变荧光强度，VO-P=(Ft-F0)/(Fm-F0)，Ft表示t时的荧光强度，F0表示暗适应后的最小荧光强度，Fm表示暗适应后的最大荧光强度；C，F0与Fm间相对可变荧光强度差值△VO-P，△VO-P=VO-P(处理)-VO-P(CK)；D，F0与FJ间相对可变荧光强度差值△VO-J，计算方式同△VO-P；E，F0与FK间相对可变荧光强度差值△VO-K，计算方式同△VO-P；O、L、K、J、I、P各点含义详见文献[25]

2.3 温度对快速叶绿素荧光诱导动力学曲线参数的影响

2.3.1 对PSII供体侧的影响

随着温度由低到高，VK的变化呈U型，其中5、45 ℃时与CK达到显著差异，表明5、45 ℃的环境温度会造成PSII供体侧损伤(图3)。

2.3.2 对PSII反应中心的影响

5和45 ℃时VL上升显著，表明上述温度会导致PSII各单位之间的能量流通不畅。在各处理温度下，RC/CSO均无显著差异，可见5～45 ℃的环境温度对PSII单位面积反应中心数量无影响。与25 ℃相比，15 ℃和5 ℃时ABS/RC、TR0/RC和DI0/RC均无显著差异，35 ℃时DI0/RC显著上升到CK的1 626.4%，45 ℃时3项参数分别比CK显著增加153.6%、135.4%和1 404.7%，表明低温(15 ℃和5 ℃)对PSII单位反应中心吸收、捕获和热耗散能量的功能无显著影响，当温度升至35 ℃时以热能形式耗散的能量开始大幅度增加，45 ℃时吸收、捕获和热耗散的能量均显著增加(图3)。

图3 温度降低对快速叶绿素荧光诱导动力学曲线参数的影响

2.3.3 对PSII受体侧的影响

仅在45 ℃时ET0/RC显著升高到25 ℃的141.0%，显示了单位反应中心用于将电子从QA-传递到PQ的能量在5～35 ℃的范围内均较稳定。15和5 ℃时RE0/RC分别是25 ℃的58.7%(P<0.05)和132.7%(P<0.05)；与25 ℃相比，35和45 ℃时的RE0/RC呈现持续显著降低，表明低温造成最终传递到PSI的能量出现大幅度波动，而高温严重阻碍了这条路径的能量传递。

当温度从25 ℃降至15 ℃时，φP0、ψE0和δR0分别降低到25 ℃的90.8%、84.7%(P<0.05)和50.8%(P<0.05)，5 ℃时3项参数又有不同程度回升，表明15 ℃短暂抑制了PSⅡ的电子传递效率，其抑制程度随着电子传递链延长而愈加严重。35和45 ℃导致上述3项参数均显著下降，35 ℃时就分别仅为25 ℃的38.9%、42.4%和5.8%，反映出高温比低温对PSⅡ电子传递效率的负面影响更加严重(图3)。

2.3.4 对PIABS的影响

随着温度升高，PIABS的变化呈现倒U型，15、25、35 ℃时无显著差异，5和45 ℃时显著降低至25 ℃的21.6%和36.8%，表明5和45 ℃的环境温度对南极假山毛榉叶片的光能吸收会形成严重的冷害和高温胁迫(图3)。

2.4 区域指标统计

对辽东栎分布数据进行终筛后，共获得164个有效分布点。分布点集中的地理分布范围为北纬 30.0°～42.5°和东经102.0°～125.0°，主要位于我国的华北、东北的南部和西北的东部。所有分布点的最热月份最高温的平均值为(27.8±3.7)℃，95%置信区间为27.1～28.3 ℃(图4)。

2.5 辽东栎PIABS温度响应模型的建立与检验

Sine函数能较好地对PIABS的温度变化曲线进行拟合，决定系数(R2)为0.98。从拟合模型曲线看，PIABS随着温度升高呈S型增加，28.1 ℃时达到极大值，之后开始下降，反映出28.1 ℃是辽东栎PSⅡ光化学活性的最适温度。经过比较，可见PIABS温度变化模型的峰值处于最热月份最高温正态分布曲线的95%置信区间内(图5)。

图4 辽东栎分布点的经纬度和最热月最高温箱图

实线表示 PIABS的拟合曲线，R2=0.98；虚线表示164个辽东栎分布点最热月份最高温的正态分布曲线，灰色区域是其95%的置信区间

3 讨论与结论

研究发现辽东栎1年生苗PSII的光化学活性在5 ℃和45 ℃时会遭受严重的低温和高温胁迫，15～35 ℃的环境温度对PIABS无显著影响，其内在形成机理如下所述。5 ℃时叶绿素含量降低，同时PSII供体侧损伤严重，PSII反应中心QA与QB之间的电子传递也受阻，所以导致PSⅡ光化学活性大幅度降低。15 ℃时PSⅡ光化学活性所受影响轻微，主要是PSI受体侧受损。35 ℃造成最终传递到PSI的能量出现大幅度减少，对PSⅡ电子传递效率也有较严重的负面影响，但此环境温度有利于叶绿素含量增加，同时热耗散的大幅度增加保护了PSⅡ反应中心，所以PIABS的与25 ℃时无显著差异。45 ℃在造成叶绿素含量下降的同时，对PSII供体侧、PSII各单位之间的能量流通、PSII受体侧的能通量和电子传递效率均造成严重伤害，OJIP曲线显示电子从QA-向QB传递的路径是高温伤害的主要发生部位。为应对大量能量积聚在PSII反映中心引发的光破坏，PSII吸收、捕获和热耗散的能量均显著增加，但仍然导致PIABS显著降低，发生了严重的高温胁迫。

低温胁迫会导致OJIP曲线趋向平缓、O相升高、J相下降或上升、I相和P 相下降、K 点和L点出现[3, 27,28]等变化，反映出PSII有活性的反应中心数量减少，反应中心吸收和热耗散的能量增加，以及PSII受体侧的电子传递速率降低等光合作用的“内在变化”[4,5, 28,29]。温度胁迫还会使叶片叶绿素降解[30，31]，导致光合作用的物质基础发生改变。低温5 ℃处理下辽东栎OJIP曲线的O、K、J、I、P各相，以及SPAD的变化与前述研究结果相似，但虽然5 ℃时PSII受体侧的电子传递速率显著下降，但表征PSI受体侧能通量和电子传递效率的参数RE0/RC、φP0、ψE0和δR0在经历了15 ℃的短暂下降后，5 ℃时均大幅度回升。Shi等[32]研究表明，植物暴露于冷害胁迫15 min后就可以激活C重复序列结合因子和冷响应基因，进而编译出渗透蛋白和低温保护蛋白，以帮助植物抵御更严苛的低温胁迫。鉴于此，5 ℃下前述4项参数的变化很可能因为之前15 ℃的低温驯化的效应，导致叶绿体的类囊体膜得到修复，从而加强了PSII与PSI之间的能量和电子的传递效率。高温胁迫同样会导致OJIP曲线O相升高，J相下降或上升，I相和P 相下降，并出现明显 K 点[5,6, 27, 33,34]，本研究中辽东栎OJIP曲线也出现了相似变化。辽东栎PSII反应中心吸收、捕获和热耗散的能量增加现象，与刘倩倩等[27]和Zhang等[35]的研究结果相符，但PSII有活性反应中心数量的减少，以及PSII受体侧电子传递速率的增加等变化与上述研究相异，可能预示了辽东栎较前述研究的试验对象更耐热。

同一物种的叶绿素荧光特性在高低温胁迫下也存在差异，例如Zushi等[36]对比高温(40 ℃)与低温(4 ℃)处理下番茄Solanumlycopersicon叶片的JIP-test参数后发现，高温胁迫对PSII电子传递的影响更严重；刘倩倩等[27]对辣椒Capsicumannum做类似处理时发现高温胁迫对PSII供体侧的损伤大于低温胁迫。高温(45 ℃)与低温胁迫(5 ℃)对辽东栎OJIP曲线和JIP-test参数的影响也存在较大差异。从OJIP曲线看，45 ℃的高温胁迫导致辽东栎OJIP曲线的I相下降明显，而5 ℃低温则导致J相上升明显；从JIP-test参数看，45 ℃高温胁迫的主要作用位点是PSI供体侧的电子传递链，5 ℃低温胁迫的主要作用位点则是PSII供体侧及其受体侧的能通量。研究结果与前述两项研究结论有差异，可能与种间差异有关，但辽东栎的高低温胁迫差异可以作为特殊标记，识别高低温胁迫的发生。

关于辽东栎的分布范围，殷晓洁等[24]采用资料检索的方法，发现其潜在分布区位于我国东北南部、华北中南部、华中西北部、华东北部、西南东部部分地区及西北东部地区；厉月桥[37]采用实地考察的方法，明确了辽东栎的地理分布范围为北纬31°27′～41°08′和东经102°29′～126°11′，本研究确定的辽东栎分布范围与上述研究结论基本相符。研究中发现模型预测的PIABS最适温度值，正好处于辽东栎分布点最热月份最高温的95%置信区间，可能预示辽东栎倾向于在光能利用率高的地区分布，同时也表明，从区域尺度和单株尺度获得的2类辽东栎温度因子阈值可能存在极高的关联性。从光合作用光能利用的角度看，研究结果表明15～35 ℃的环境温度适合辽东栎1年生苗的培育，其最适温度为28.1 ℃。虽然28.1 ℃处于辽东栎分布点最热月份最高温的95%置信区间，但存在树龄差异、试验温度间隔较大、温度对光合作用碳固定和酶活性的影响等因素影响，可能会降低本研究预测温度的精度，因此还需要进一步试验，寻找辽东栎幼苗的最适培养温度。

15～35 ℃的环境温度对辽东栎1年生苗PSII的光化学活性无显著影响。5和45 ℃时PIABS遭受严重的低温和高温胁迫，主要因为5 ℃时PSII供体侧严重受损，以及45 ℃时PSII受体侧的能通量和电子传递效率严重降低所致。PIABS的温度响应曲线可用Sine函数进行拟合，该模型峰值为28.1 ℃，处于164个辽东栎分布点的最热月份最高温的95%置信区间内，表明PIABS温度响应模型的预测结果较为准确。辽东栎叶片PSII光化学活性的最适温度为28.1 ℃。