杂交滇丁香花香释放规律研究

李钰莹，徐洪雨，马宏，李正红*

(1.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801；2.中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所，北京 100193；3.中国林业科学院 资源昆虫研究所，云南 昆明 650224)

滇丁香属(Luculia)植物是一类花型漂亮、花期长和花香浓郁的木本花卉，具有开发价值[1]。滇丁香属植物在世界范围内主要分布于亚洲南部至东南部，在我国有3个种和1个变种，分布于广西、云南和西藏地区。滇丁香(Luculiapinceana)在我国的分布范围最广，花色丰富、易人工栽培。与另一品种鸡冠滇丁香(Luculiayunnanensis)相比，滇丁香的花朵略小。鸡冠滇丁香花型丰富、花香馥郁，作为我国特有植物，仅分布在云南的怒江地区，其分布范围窄、对生境要求高。

对于木本花卉，株型、花型和花香是影响其推广的最重要的农艺性状。在滇丁香属植物的推广中，利用现有的滇丁香属植物种植资源，培育花香馥郁、花型优美和花色多变的新品种是首要工作。在园艺植物新品的培育工作中，杂交育种是一种能够改善其农艺性状的重要技术手段[2～4]。单从滇丁香易于人工栽培的特点，它可以作为滇丁香属植物推广的首选品种。但本研究组在过去的研究中发现，滇丁香花香成分中苯环类物质的相对含量较高(51.61%以上)[5]，花香气味不佳，影响推广。鸡冠滇丁香花香挥发物中萜类物质相对含量较高(64.67%以上)[6]，与滇丁香花香成分差异大，两者花香各具特色。为培育出香型新颖、馥郁的新品种，本研究组以采自云南省怒江州的鸡冠滇丁香为父本(25°58′N，98°48′E)、人工栽培滇丁香为母本，在云南省楚雄州禄丰县滇中高原试验站(25°13′N，102°12′E)进行了杂交试验。本研究以滇丁香杂交一代F1(以下简称杂交滇丁香)及其父母本为研究材料，采用HS-SPME-GC-MS技术，对杂交滇丁香及其父母本的花香成分和花香释放规律进行测定，对比杂交滇丁香与父母本花香成分的差异，讨论杂交滇丁香的花香成分与父母本的关系，旨在为未来杂交滇丁香属植物的花香育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及取样

植物来源：花香检测所用的父本鸡冠滇丁香花序样品采自云南省怒江州(25°58′N，98°48′E)，滇丁香和杂交滇丁香的花序采自禄丰试验站。取样时，每种滇丁香属植物选择3株，每株选择3个完整花序。所取的花序样品瓶插(蒸馏水)后带回实验室(云南省昆明市资源昆虫研究所)，所有花序样品在瓶插3 d后进行花香成分的测定。

样品的采集：在开花时节，按花朵发育进程花蕾期(Ⅰ)、初花期(Ⅱ)、盛花期(Ⅲ)和衰花期(Ⅳ)4个时期分别对3种滇丁香属植物的花香成分进行检验。检测时，每个花期阶段从每个花序中选1朵花进行花香测定，即每个处理共测9个重复。

1.2 试验设备

花香的测定使用HP-SPME顶空-固相微萃取全自动进样台(Thermo Fisher Scientic, USA)和TRACE GC Ultra/ITQ900气质联用仪(Thermo Fisher Scientic, USA)。萃取头为PDMS 100 μm(Supelco，USA)，色谱柱为DB-5MS(Agilent J&W scientific, USA)。

1.3 试验方法

花香的收集采用顶空固相微萃取法。取大小一致的花朵，除去花柄后放入15 mL透明玻璃样品瓶。然后，向瓶中插入萃取头，25 ℃条件下顶空吸附40 min。

GC/MS分析时，色谱条件：进样口温度设置为250 ℃；升温程式为起始温度40 ℃，保持2 min，然后以6 ℃·min-1的速度将温度升高到130 ℃，再以15 ℃·min-1的速度升高到280 ℃，保持5 min;质谱条件：离子源温度250 ℃，电子能量70 eV，全扫描模式，传输线温度200 ℃，扫描质量范围为50～650 amu。

在保留指数的计算中，色谱纯为C6～C19正构烷烃(Supelco，USA)，样品进样量为0.1 μL。按上述条件进行GC/MS分析时，记录下14个正构烷烃的保留时间，然后再根据线性升温公式计算出各花香成分的保留指数(linear retention index，LRI)。

式中，LRI为保留指数；tx为待测组分的保留时间/min；tn为具有n个碳原子正构烷烃的保留时间/min；tn+1为具有n+1个碳原子正构烷烃的保留时间，min。

1.4 数据统计分析

在对所测定的花香成分进行定性分析时，使用TF Xcalibur 2.1.0软件对挥发性化合物的质谱图进行分析，参考标准图片数据库(National Institute of Standards and Technology，NIST08)进行检索，检索后人工辅助对质谱图进行解析，并参考科学文献中各挥发物成分的保留指数进行验证。

对花香挥发物成分进行相对定量分析时，采用面积归一化法分析质谱图，从而求得各组分的相对含量。各花香成分相对含量的计算公式如下：

使用PC-ORD5.0软件(MjM Software, Gleneden Beach, OR, USA)，根据各挥发物峰面积大小进行主成分分析(PCA)和Bray-Curtis相似性(BCS)分析。

2 结果与分析

2.1 父本鸡冠滇丁香花香的挥发物成分

父本鸡冠滇丁香的花香成分中共包含40种物质(附表1)。据表1可知，在花蕾期、初花期和衰花期中，萜类物质的相对含量均超过90%，而在盛花期中萜类物质占比86.24%。由此可见，鸡冠滇丁香的花香的主要成分为萜类物质。从花蕾期到初花期和盛花期，苯环类化合物相对释放量逐渐升高，并在盛花期达到最高，为12.90%。从花蕾期到衰花期，脂肪族化合物的相对含量在初花期和盛花期有所降低，而到衰花期时，脂肪族化合物的相对含量再次升高至初花期时的大小。

在4个花期阶段的花香成分中，相对含量较大的物质有3-Carene、α-Cubebene、α-Copaene、Isoledene、δ-Cadinene和Cadine-1,4-diene，这几种物质均为萜类。与本研究的另外两种滇丁香(杂交滇丁香和滇丁香)相比，鸡冠滇丁香的花香成分中丹皮酚(Paeonol)的相对含量较少，且仅在盛花期中检测到了此物质，相对含量占比12.73%。

注：同列不同小写字母表示该类化合物不同阶段间差异显著(P<0.05)

Note: Letters in each column mean significant difference in one substance among the four stages(P<0.05)

2.2 母本滇丁香花香的挥发物成分

母本滇丁香的花香成分中共包含39种物质(附表2)。据表2可见，滇丁香花香的主要成分为苯环类化合物和萜类。在4个花期阶段中，苯环类化合物和萜类的共占比达到97%以上。在花蕾期，萜类和苯环类化合物的相对含量相差较小，均约为50%。在初花期，苯环类化合物的相对含量快速升高，达到85.88%。在盛花期和衰花期，苯环类化合物的相对含量有所降低，但其相对相对含量仍在75%以上，萜类的相对含量有所提高。初花期和盛花期为滇丁香赏花的关键时期，而在这两个时期，滇丁香花香挥发物组分中苯环类化合物的相对含量均超过80%。

表2 母本滇丁香花香中各挥发物组分所占的比例

注：同列不同小写字母表示该类化合物不同阶段间差异显著(P<0.05)

Note: Letters in each column mean significant difference in one substance among the four stages(P<0.05)

在滇丁香的花香成分中，丹皮酚的相对含量最高，在4个时期其相对含量分别占比51.58%、83.03%、79.72%和69.75%。除丹皮酚外，相对含量较大的物质还有(E, E)-α-Farnesene(萜类)、Cyclosativene(萜类)、Isoledene(萜类)、Cubedol(萜类)和δ-Cadinene(萜类)。

2.3 杂交滇丁香花香的挥发物成分

杂交滇丁香的花香成分共包含50种物质(附表3)。据表3可知，杂交滇丁香花香的主要成分为苯环类化合物，其中主要物质为丹皮酚。在4个花期阶段中，丹皮酚所占的相对含量均在90%以上，具体分别为92.09%、93.86%、91.56%和90.42%。在杂交滇丁香的花香成分中，萜类物质的相对含量较少，其在4个时期呈现先升高后下降的变化趋势，在盛花期达到最大，为5.99%。

表3 杂交滇丁香花香中各挥发物组分所占的比例

注：同列不同小写字母表示该类化合物不同阶段间差异显著(P<0.05)

Note: Letters in each column mean significant difference in one substance among the four stages(P<0.05)

2.4 杂交滇丁香花香与父母本的异同

经过对3种滇丁香属植物花香组分的分析发现，杂交滇丁香花香组分中特有的物质共有15种，具体分别为1,3,5-Cycloheptatriene；1,6-Heptadien-3-yne；2′,4′-Dihydroxy-3′-methylacetophenone；Benzene, hexyl-；Retinal；2,6-Bis(1,1-dimethylethyl)-4-(1-oxopropyl)phenol；Acetic acid, 2-phenylethyl ester；Benzene ethanamine, a-methyl-；Benzene ethanamine, N-methyl-；Benzene, 1,3-dimethyl-；Dibutyl phthalate；Formic acid, 2-phenylethyl ester；Isolongifolol；Isoretinene A；α-Farnesene。在4个花期阶段，这些特有物质占花香释放量的比例在1.59%～6.19%之间。

父本鸡冠滇丁香花香组分中特有的物质共有10种，具体分别为(-)-Aristolene；6,7-Dimethyl-1,2,3,5,8,8a -hexahydronaphthalene；Benzene, 1,2,3-trimethoxy-5-(2-propenyl)-；cis-Muurola-3,5-diene；Humulene；Isopropyl myristate；Naphthalene,1,2,4a,5,6,8a -hexahydro-4,7-dimethyl-1-(1-methylethyl)-；Phenylethyl alcohol；Propanoic acid, 2-methyl-, 2-ethyl-3-hydroxyhexyl ester；α-Guaiene。在4个花期阶段中，这些特有物质占鸡冠滇丁香花香总释放量的比例在8.29%～16.71%之间。

母本滇丁香花香组分中特有的物质共有8种，具体分别为(3E,5Z)-1,3,5-Undecatriene；(E)-β-Ocimene；(Z)-Verbenol；Cyclosativene；Nonanoic acid,ethyl ester；Pentanoic acid, 2,2,4-trimethyl-3-carboxyisopropyl, isobutyl ester；Perilla alcohol；Phenol,2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-(1-methylpropyl)。在4个花期阶段中，这些特有的挥发性物质占滇丁香花香总释放量的比例在1.21%～6.21%。

为分析杂交滇丁香花香成分及相对含量与父母本之间的异同，本研究采用主成分分析法对3种滇丁香属植物在4个时期的花香挥发性物(包括物质成分和相对含量)进行比较分析，结果见图1。从图中可以看出，通过主成分分析的降幂处理，杂交滇丁香、滇丁香和鸡冠滇丁香分处在不同的象限中，主成分分析法能够有效地将杂交滇丁香与父母本的花香成分区分开，花香的挥发物组成及相对含量在三者之间差异的很大。

为进一步分析杂交滇丁香与父母本在4个时期的花香挥发性物(包括成分及相对含量)的异同，进一步采用Bray-Curtis相似性分析法对其进行比较分析，结果见表4。从表4可知，在4个时期，滇丁香与鸡冠滇丁香的花香(包括成分和相对含量)差异较大，两者相似度在7.35～51.55之间。此外，滇丁香仅在花蕾期与鸡冠滇丁香的相似度较高，约30%～50%。

在子一代杂交滇丁香与父母本花香(成分及相对含量)相似度的比较中，杂交滇丁香与父本鸡冠滇丁香的相似度较低，除鸡冠滇丁香在盛花期与杂交滇丁香的相似度能够达到10%～20%外，在其余阶段的相似度均低于5%。而在杂交滇丁香与母本滇丁香花香的比较中，除滇丁香在花蕾期与杂交滇丁香的相似度在52%～56%外，在其余阶段的相似度均在70%以上。

综上所述，父本鸡冠滇丁香与母本滇丁香和子一代杂交滇丁香花香成分的相似度均不高，而子一代杂交滇丁香与母本滇丁香花香成分的相似度却极高。

表4 杂交滇丁香与父母本花香成分的相似度

注：(I)花蕾期；(II)初花期；(III)盛花期；(IV)衰花期

Note:(I)Bud stage;(II)Initial-flowering stage;(III)Full-flowering stage; and(IV)End-flowering stage

Ⅰ: 花蕾期; Ⅱ: 初花期; Ⅲ: 盛花期; Ⅳ: 衰花期

2.5 杂交滇丁香花香释放量在时间上的变化

图2为杂交滇丁香及其父母本花香成分测定时的总离子色谱图。由图2可见，滇丁香属植物花部挥发物的释放量随花部发育的进程呈规律性变化。杂交滇丁香同父母本一致，在4个开花阶段，花香的释放量均呈单峰模式。具体释放模式为：花香的释放量在初花期达到最大，而在盛花期和衰花期呈逐渐下降趋势。

在4个开花阶段，父本鸡冠滇丁香和母本滇丁香在每一阶段释放的花香均是多峰的，由此说明二者的花香成分比较复杂。而杂交滇丁香在每一开花阶段花香的释放均是单峰的，其原因是由于杂交滇丁香花香的主要成分为丹皮酚，在4个阶段，花香组分中丹皮酚的相对含量均达到90%以上。

Ⅰ: 花蕾期; Ⅱ: 初花期; Ⅲ: 盛花期; Ⅳ: 衰花期

3 讨论

本研究不仅分析了杂交滇丁香花香的成分，还对杂交滇丁香与父母本花香成分的异同进行了比较。结果发现，丹皮酚这一苯环类物质是杂交滇丁香和母本滇丁香花香的主要成分，而父本鸡冠滇丁香的花香主要成分却为萜类物质。与滇丁香属的其它植物相比，馥郁滇丁香(Luculiagratissima)花香挥发物的主要成分是倍半萜类物质[7]。而在同为茜草科的Posoqueria属中，Posoquerialatifolia花香挥发物主要成分也为倍半萜类[8]，但风箱树属Cephalanthusoccidentalis[9]、猩猩木属Warszewicziacoccinea[9]和栀子花属Gardeniajasminoides[10]植物花香挥发物的主要成分是单萜类，咖啡树属CoffeaArabica[11]植物花香挥发物的主要成分则为脂肪烃类。由此可见，虽是同科植物，花香挥发物的主要成分并无规律可循。前人的研究还发现，花香挥发物的主要成分即便是在近源物种之间也会有较大差异[12]，滇丁香属植物亦是如此。

鸡冠滇丁香和滇丁香分别作为杂交滇丁香的父本和母本，鸡冠滇丁香花香挥发物的主要成分是萜类物质，滇丁香花香的挥发物主要成分是萜类和苯环类，而杂交滇丁香花香挥发物的主要成分是苯环类，与滇丁香的花香成分更为接近。Hiroshi等曾用亚细胞定位的方法，确定出苯丙素类物质合成的莽草酸途径中所涉及到的酶均存在于质体[13]。在被子植物农艺性状的遗传中，共有单亲母系质体遗传、单亲父系质体遗传和双亲质体遗传3种类型[14]，其中单亲母系质体遗传占比较大，仅有很少数植物采用双亲质体遗传和单亲父系质体遗传，如紫茉莉科紫茉莉Mirabilisjalapa[15]、杜鹃花科迎红杜鹃Rhododendronmucronulatum[16]、牻牛儿苗科天竺葵属植物Pelargoniumspp.[17]等属于双亲质体遗传，豆科紫苜蓿Medicagosativa[18]、十字花科胡萝卜属植物Daucusspp.[19]、旋花科牵牛属植物Pharbitisspp.[20]等属于单亲父系遗传。但是，在滇丁香属植物乃至茜草科中均未能查到关于质体遗传方面的研究。假设滇丁香属植物属于单亲母系质体遗传，那么杂交滇丁香花香挥发物中苯环类物质的含量较高就不难解释了。以滇丁香为母本，通过母系质体遗传，杂交滇丁香因此继承了母本滇丁香编码合成苯环类物质的酶的基因。

萜类物质蒈烯(3-Carene)具有柠檬和松脂的香味，α-荜澄茄油烯(α-Cubebene)具有青草香，α-胡椒烯(α-Copaene)具有木材和香料的香味，杜松烯(δ-Cadinene)具有百里香和木材的香味，而鸡冠滇丁香花香的主要成分就是这些萜类，并且其含量都在90%以上。虽然滇丁香的花香成分中含有一定比例的萜类，但是苯环类物质的相对含量却要高很多。而对于杂交滇丁香，在本研究的4个时期，苯环类物质的相对含量均在90%以上。苯环类物质，尤其是丹皮酚，它是具有特殊气味的物质，不能令人产生愉悦感。由此可见，在对滇丁香属植物中进行育种时，若以花香育种为目标，以鸡冠滇丁香作为母本，或许是一条避免杂交滇丁香花香中丹皮酚含量过高的途径。

本研究中滇丁香、鸡冠滇丁香和杂交滇丁香花香大量释放的时间均是在初花期。在过去对植物花香释放规律的研究中，有些植物花香大量释放的时间是在盛花期，如柠檬罗勒(Ocimumcitriodorum)[21]和玉簪(Hostaventricosa、H.‘Moonlight Sonata’和H.plantaginea)[22]；有些植物则是在花蕾期，如红眼金合欢(Acaciacyclops)[23]；还有些植物是在初花期，如“波叶金桂”(Osmanthusfragrans‘Boye Jingui')[24]。因此，不同的植物，其花香挥发物组分与释放规律不尽相同，可能是与吸引不同习性的传粉昆虫有关[25]。

4 结论

滇丁香属植物花香的主要成分为萜类和苯环类化合物。在杂交滇丁香和母本滇丁香的花香成分中，苯环类的丹皮酚相对含量最高。父本鸡冠滇丁香花香成分中，萜类物质的相对含量最高，苯环类化合物(包括丹皮酚)的相对含量很少。与父本相比，杂交滇丁香的花香成分与母本滇丁香的相似度更高。杂交滇丁香花香释放的最大量出现在初花期，花香释放呈先升高后降低的单峰模型，与父母本保持一致。杂交滇丁香在每一开花阶段花香的释放均为单峰，与其花香成分中仅丹皮酚的相对含量就占比90%以上有关。