ICSI对高龄非男性因素不孕患者生育结局的影响

朱家红，刘卫卫，王江，韩伟，黄国宁

(重庆市妇幼保健院遗传与生殖研究所，重庆 400013)

ICSI是治疗严重男性不育症最有效的方式，能够使受精率大幅提高且临床结局得到显著改善。自ICSI开始应用以来，其使用率不断增高且应用指征也越来越广泛[1]。文献报道欧洲IVF监管中心统计的2014年39个国家1 279个生殖中心共进行了508 433例新鲜周期，其中ICSI占比为71.3%，呈逐年上升趋势[2]。此外，ICSI除了广泛应用到男性不育症的治疗外，已扩大应用到胚胎植入前遗传学检测、≥2次辅助生殖技术(ART)助孕失败、受精失败或受精不良、高龄、获卵数少等原因引起的不孕症以及不明原因不孕症患者。当前国内外学术界均对ICSI指征是否应该扩大到这些因素存在较大争议，有些文献认为ICSI可改善高龄患者的受精率和胚胎质量[3]，临床结局也更好[4]；然而有些文献认为ICSI不能改善临床结局[5]；甚至有些文献认为高龄患者卵母细胞质量较差，ICSI的侵入性操作会使临床结局更差[6]。ICSI对于高龄非男性因素不孕患者临床应用结局的影响，相关文献报道较少，需要更多的研究来探讨ICSI治疗的应用范围。目前比较普遍认可将35岁以上的妇女定义为生育高龄妇女，大多数生殖中心35～37岁妇女ART助孕的成功率呈缓降趋势，≥38岁的高龄女性活产率明显下降，流产率显著增高。本研究对高龄(≥38岁)、非男性不孕因素患者行ICSI和常规IVF助孕的临床结局进行统计分析，探讨ICSI的应用范围。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析2016～2018年间在重庆市妇幼保健院遗传与生殖研究所接受ART治疗的高龄、非男性因素不孕患者IVF或ICSI的临床结局资料。入组标准：(1)行微刺激方案；(2)女性年龄≥38岁；(3)男方精液正常、行IVF或ICSI人工授精的周期。排除标准：男方精液异常的周期。

精液正常标准：根据WHO人类精液实验室检验手册(第5版)标准提示精液正常且无抗精子抗体，具体为：浓度>15×106/ml，总活力>40%，前向运动>32%，正常形态>4%，体积>1.5 ml。

二、研究方法

1.分组：根据受精方式分为ICSI组和IVF组。前次IVF授精无2PN胚胎故取消周期再次ICSI助孕的纳入ICSI组(189例，共334个周期)；选择同期、与ICSI组年龄及获卵数条件平衡的189例无受精问题取消史的患者为IVF组(共325个周期)。

2.人工授精及培养：患者接受克罗米芬微刺激促排卵、HCG注射后36 h取卵，将获得的卵母细胞培养2～4 h后行人工授精。ICSI授精前脱颗粒，选择MⅡ期卵母细胞行ICSI授精。ICSI操作：精子制动后吸入注射针，使精子头部位于注射针尖端，并移入含有卵母细胞的微滴中，固定针固定卵母细胞，使第一极体位置位于11～12点位置或者6点位置，注射针穿过透明带进入卵胞质内，回吸胞浆液至卵母细胞破膜后将精子缓慢注入卵母细胞中心区域，再缓慢退出注射针。IVF授精：采用50 μl微滴受精法，使用巴斯吸管以约1万条精子/50 μl的密度加精入受精皿微滴中，每微滴加1枚卵母细胞。受精后18～20 h观察原核情况，培养至第3天(D3)根据形态学评估选择可用胚胎行玻璃化冷冻保存待冻融胚胎移植(FET)备用。

3.观察指标：统计IVF或ICSI后2PN受精率、优胚率、周期取消率及冷冻率，FET后的流产率、活产率及新生儿出生结局。IVF中2PN受精率=D1出现2PN卵子数/IVF加精卵子总数×100%；ICSI中2PN受精率=D1出现2PN卵子数/注射MⅡ卵子总数×100%；优胚率=优质胚胎数/正常受精卵裂胚胎数×100%；周期取消率=取消周期数/采卵周期数×100%；冷冻率=冷冻胚胎数/2PN卵裂胚胎数×100%；流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%；活产率=活产周期数/移植周期数×100%；早产率=早产(妊娠满28周至不足37周分娩)周期数/活产周期数×100%；低体重出生率=低体重出生儿(出生时体重<2 500 g)数/总出生胎儿数×100%。

三、统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，组间均数比较符合正态分布的采用t检验，不符合正态分布的采用秩和检验；率的比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、两组患者的基本资料比较

ICSI组189例患者共334个周期，IVF组189例患者共325个周期；ICSI组女性平均年龄(41.86±2.26)岁(38～52岁)，IVF组女性平均年龄(42.08±2.62)岁(38～51岁)。两组之间除了ICSI组的不孕年限显著高于IVF组(P<0.05)外，其余指标如平均年龄、体重指数(BMI)、Gn总量、Gn天数和获卵数比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

二、两组患者受精后结局比较

ICSI组中由于异常卵或未成熟卵取消8个周期，实际326个周期行ICSI。IVF组实际受精325周期。受精后ICSI和IVF组由于无2PN胚胎分别取消周期31个和36个，由于胚胎质量差而无可移植胚胎分别取消周期44个和48个；IVF组由于异常卵或未成熟卵取消7个周期。ICSI组MⅡ卵率显著低于IVF组(P<0.05)，但2PN受精率和2PN卵裂率显著高于IVF组(P<0.05)；两组的胚胎冷冻率、优质胚胎率、取消周期率比较无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表1 两组患者的基本资料比较(-±s)

注：与IVF组比较，*P<0.05

表2 ICSI组和IVF组受精结局比较(%)

注：与IVF组比较，*P<0.05

三、两组患者FET后临床结局比较

成功行FET的ICSI组和IVF组两组之间的年龄、平均移植胚胎数和子宫内膜厚度均无显著性差异(P>0.05)；FET后两组间的着床率、流产率和活产率也均无显著性差异(P>0.05)；ICSI组由于两例双胎活产，低体重出生率和早产率均略高于IVF组，但无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表3 FET后ICSI组和IVF组临床结局比较[(-±s)，%]

讨 论

本中心对于女性高龄患者通常采用微刺激方案，由于高龄患者通常卵巢储备功能低下、获卵数少，并且随着年龄增加卵母细胞质量显著降低，更容易发生不受精或异常受精，发育潜能较低，可利用胚胎数少，导致临床结局差甚至取消周期。因此选择合适的授精方式，提高正常受精胚胎数量和质量是改善此类患者结局的关键。

一、ICSI不能排除受精后无2PN胚胎取消周期的风险

受精过程机制复杂，主要与卵母细胞的质量、精-卵结合过程、培养环境及体外操作相关。文献表明男方精液检查结果正常的不孕患者将近41%存在精子不能结合、穿透透明带或透明带功能异常[7]。此类患者再次改行ICSI助孕可显著改善其受精结局，与本文ICSI组统计结果一致。说明ICSI可克服年龄相关的精卵结合异常、卵母细胞透明带功能异常引起的不受精或多精受精情况，对于此类患者ICSI是有效的，且本研究结果显示ICSI组可获得的临床结局与IVF组无显著性差别。本研究结果显示IVF组受精后无2PN胚胎取消周期率为11.08%(36/325)，而ICSI组的为9.28%(31/334)，说明ICSI仍不能排除高龄非男性因素不孕患者再次助孕ICSI受精后2PN胚胎取消周期的风险。

二、卵母细胞质量是影响受精的关键

本研究结果显示IVF组MⅡ卵率显著高于ICSI组，但2PN率却显著降低，0PN率显著增高，两组之间的异常受精率无显著性差异。可能的原因是IVF组脱颗粒时间更晚，未成熟的卵母细胞在期间培养成熟并参与了受精的过程。文献表明卵母细胞成熟度与其受精能力密切相关，如卵母细胞中低拷贝数线粒体DNA、纺锤体功能异常、皮质颗粒分布异常以及Ca2+通道异常导致卵母细胞激活失败均可导致不受精[8-9]。不成熟的卵母细胞多精受精率高达32%～42%，而成熟卵母细胞发生率仅6%左右[9]。IVF异常受精最常见的原因是透明带功能的异常导致多精受精，还可能是精子或卵母细胞为非单倍体配子。ICSI异常受精主要为单原核合子的形成，即孤雌生殖激活，与卵母细胞的成熟度以及ICSI操作过程中Ca2+水平的变化继发引起。因此对于高龄患者改善卵母细胞质量才是影响受精和临床结局的关键。

三、ICSI不能改善高龄非男性因素不孕患者的胚胎质量和临床结局

ICSI为侵入性操作，可能对胚胎造成损伤影响胚胎发育[10]，甚至导致卵母细胞坏死，本研究中ICSI后卵母细胞坏死率为5.25%(32/610)，其对胚胎室操作人员技术要求较高。有文献认为ICSI可提高高龄非男性因素患者的受精率和优质胚胎的质量[11]，原因是ICSI避免了卵母细胞与大量精子一起培养的过程，精子会产生多种活性氧，这些活性氧与胚胎的损害相关[12]。但本研究结果中两组之间的优胚率及胚胎冷冻率无显著性差别，ICSI组正常受精率显著升高的原因可能是ICSI前已排除不成熟的卵母细胞，这与文献报道[13-15]的受精方式与胚胎质量无关一致，甚至有文献表明ICSI用于高龄患者更容易发生生化妊娠流产[16]，会导致其临床结局更差[5]，相反选择IVF助孕方式可能更有益于胚胎的发育[17]。说明ICSI并不能改善与年龄相关卵母细胞的质量下降带来的受精失败或异常受精，不应将单纯高龄或获卵数少作为ICSI的指征。

综上所述，本研究建议高龄非男性因素不孕患者首次助孕应选择IVF授精方式，而前次无2PN胚胎取消周期史的患者再次助孕选择ICSI可以有效改善妊娠结局。