囊胚玻璃化冷冻保存时长对复苏移植临床结局的影响

肖亚玲，王雪，孙正怡，甄璟然，郁琦，邓成艳，周远征，王含必

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院妇科内分泌与生殖中心，北京 100730)

随着近几年我国二胎政策的放开，越来越多通过体外受精技术生育过一胎的夫妇再次到生殖中心就诊，希望复苏前次冷冻的胚胎进行移植，于是出现了大量复苏长期冻存胚胎的情况。由于胚胎冷冻保存的时间长短不一，其复苏后的发育潜能和随后的妊娠结局是否受到冷冻时长的影响这一问题也引起了越来越多患者和医务人员的关注。冷冻胚胎保存时限的中国专家共识中提出胚胎冷冻保存6年内不影响胚胎复苏后存活率、着床率、妊娠率、活产率以及子代出生缺陷率，但是尚无足够证据证实胚胎冷冻保存时间超过6年对冻融胚胎移植安全性有影响[1]。目前国内外冷冻保存6年以上复苏移植的大样本的研究很少，出现的也多为小样本或个例报道。本研究将探讨使用开放系统囊胚玻璃化冷冻保存时长对复苏移植妊娠结局和新生儿结局的影响，进一步探讨超过6年的玻璃化冷冻保存是否对胚胎的临床结局有影响，从而对今后的临床工作进行指导。

资料和方法

一、研究对象

选取2006年3月至2018年12月期间在北京协和医院妇科内分泌与生殖中心进行玻璃化冷冻复苏囊胚移植的患者，排除各种子宫异常(包括子宫肌瘤、子宫肌腺症、子宫内膜病变及畸形子宫患者)、恶性肿瘤以及取卵年龄40岁以上的患者。最后纳入研究2 643例。根据囊胚冷冻保存时长将其患者资料分为7组：≤1年，1～2年，2～3年，3～4年，4～5年，5～6年和≥6年。

二、研究方法

1.促排卵及囊胚培养：所有患者采用激动剂降调方案或拮抗剂方案促排卵，通过阴道B超引导下进行穿刺取卵，根据患者情况进行IVF或ICSI授精操作。取卵24 h后判断受精情况，第3天评估卵裂期质量并移植，剩余全部胚胎均经患者知情同意后进行囊胚培养，第5天和第6天分别观察囊胚形成情况，采用Gardner评分法进行囊胚评分[2]，并将囊胚扩张到4期、内细胞团级别为B级及以上的囊胚进行玻璃化冷冻保存。其中内细胞团和滋养层细胞级别均在B级及以上级别的为优质胚胎。所有胚胎在37℃、5% O2、6%CO2的条件下培养。

2.玻璃化冷冻：冷冻之前使用激光对囊胚进行人工皱缩，待胚胎皱缩良好再进行冷冻。冷冻液分为3个浓度梯度，1号冷冻液为基础培养液(G-MOPS Plus，Vitrolife，瑞典)，胚胎在此液体中平衡1～2 min。2号冷冻液为含有7.5%(v/v)二甲基亚砜和7.5%(v/v)乙二醇的基础培养液，胚胎在此液体中平衡2 min，并多次轻柔吹吸。3号冷冻液为基础培养液内添加了15%(v/v)二甲基亚砜+15%(v/v)乙二醇+0.65 mol/L蔗糖+10 mg/ml聚蔗糖Ficoll，将胚胎在此液体中反复吹吸混匀至少20次，之后转移到冷冻载杆并投入液氮，3号液体操作时间为25～30 s。所有操作均在37℃工作台上进行。

3.囊胚复苏：囊胚复苏于移植当天进行。复苏液也分为3个浓度梯度，在基础培养液内，1号复苏液添加0.33 mol/L的蔗糖，胚胎在此液体中停留2 min。2号复苏液为有0.2 mol/L的蔗糖溶液，胚胎在此液体中停留3 min。3号复苏液为基础培养液，胚胎在此液体中停留5 min并用激光在远离细胞团的透明带上切割约1/4进行辅助孵化，之后转移至囊胚培养液中放入三气培养箱中培养2 h后移植。复苏操作均在37℃工作台上进行。

4.内膜准备及胚胎移植：患者内膜准备如之前文献所述[3]，分为两种方法。第一种为自然周期，在B超监测排卵前注射HCG(艾泽，默克雪兰诺，德国)，监测到卵泡破裂后第6天进行复苏移植，根据激素测定值必要时肌肉注射HCG。第二种方法为人工周期法，在月经第2～4天常规B超检查，口服戊酸雌二醇(补佳乐，先灵，德国)，当内膜厚度≥8 mm时肌肉注射黄体酮(20 mg/支，浙江仙琚制药)转化内膜，肌肉注射黄体酮后第6天进行复苏移植，移植后肌肉注射黄体酮进行黄体支持。

三、观察指标及判定标准

比较各组患者一般情况(取卵年龄、移植年龄、平均移植胚胎数、囊胚冷冻前优质胚胎率和冷冻时D5胚胎比例)，临床结局(复苏存活率、种植率、妊娠率、流产率、异位妊娠率、活产率)，活产出生结局(单胎率、出生男孩率、出生缺陷发生率)和单胎新生儿出生结局(出生体重、身长、孕天数)之间的差异；使用二分类Logistic回归分析对相关参数对临床妊娠率和活产率的影响进行分析。

种植率：B超下见到妊娠囊总数占移植胚胎总数的百分比；妊娠率：移植4周后B超下见到妊娠囊总例数与移植周期总例数的百分比；活产率：随访获得活产的总例数与移植周期总例数的百分比；流产率：在临床妊娠过程中流产的例数占临床妊娠总例数的百分比；异位妊娠率：发生异位妊娠的总例数占临床妊娠总例数的百分比；单胎率：单胎出生的总例数占活产例数的百分比；出生缺陷发生率：出生缺陷发生的总例数占活产例数的百分比。

四、统计学分析

使用spss21.0软件进行统计学分析。连续变量采用均值±标准差表示，用单因素方差分析进行组间比较；分类变量用率(%)来表示，用卡方检验(χ2)或Fisher精确检验进行组间比较。并采用二分类Logistic回归分析，以取卵年龄、移植年龄、胚胎冷冻保存时间、胚胎级别和囊胚发育速度为自变量，妊娠率和活产率为因变量，对妊娠率和活产率的影响进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、患者总体情况

本研究一共收集了2 650例囊胚冷冻复苏周期资料，其中7例因复苏后胚胎质量差或内膜等问题取消移植，复苏后取消率为0.26%，最终移植2 643例，胚胎冷冻保存时间最长为11.77年。

取卵年龄20.36～40.00岁，平均年龄(32.35±3.90)岁，移植年龄21.04～45.08岁，平均年龄(33.43±3.96)岁。复苏胚胎总数为4 739枚，其中复苏后存活4 689枚，复苏存活率为98.94%。移植胚胎总数为4 675枚，种植率为42.78%(2 000/4 675)，妊娠率为56.11%(1 483/2 643)，流产率为13.69%(203/1 483)，异位妊娠率为1.08%(16/1 483)，活产率为47.22%(1 248/2 643)，出生缺陷发生率为0.72%(9/1 248)。

二、患者一般情况比较

各组周期数、取卵年龄、移植年龄、平均移植胚胎数、移植优质胚胎率和移植D5胚胎率表1所示。单因素方差分析结果显示取卵年龄、移植年龄和优质胚胎比例各组之间差异有统计学意义(P<0.05)，≥6年组的取卵年龄显著小于其他组，而移植年龄显著大于其他组，优质胚胎率也高于其他组。各组平均移植胚胎数和D5胚胎比例无显著差异(P>0.05)(表1)。

表1 各组患者一般情况比较[(-±s)，%]

三、冷冻复苏移植临床结局比较

各组临床结局结果补充：≤1年组有3例妊娠结局失访，1～2年组1例妊娠结局失访，1例死产，3～4年组有3例妊娠结局失访，4～5年组有3例妊娠结局失访，5～6年组有3例妊娠结局失访，失访率为0.49%。卡方检验结果显示复苏胚胎存活率、妊娠率和活产率各组之间差异有统计学意义(P<0.05)，其中1～2年组的存活率、妊娠率和活产率均最低，分别为97.19%、48.87%和39.27%，而≥6年组的复苏胚胎存活率、妊娠率和活产率均高于总的存活率、妊娠率和活产率。各组种植率、流产率、异位妊娠率无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表2 各组冷冻复苏移植临床结局比较(%)

经过Logistic回归对影响妊娠率的因素进行分析，结果显示取卵年龄、移植年龄和冷冻保存的时长对妊娠率没有显著影响(P>0.05)。而移植D5胚胎比例和优质胚胎的个数对妊娠率有影响，移植全部不为D5(移植全为D6)胚胎相对于移植全部为D5胚胎的妊娠率降低[OR=0.606，95%CI(0.511，0.720)，P=0.000]；移植1个优质胚胎(包括只移植1个优质胚胎、移植1个优质胚胎和1个非优质胚胎、移植1个优质胚胎和2个非优质胚胎三种情况)和2个优质胚胎(包括只移植2个优质胚胎、移植2个优质胚胎和1个非优质胚胎两种情况)相对于移植0个优质胚胎妊娠率增加(P=0.000)(表3)。

表3 影响妊娠率因素的Logistic回归分析结果

经过Logistic回归对影响活产率的因素进行分析，结果显示取卵年龄和冷冻保存时长对活产率没有显著影响(P>0.05)。而移植年龄对活产率有影响，移植年龄的增加会降低活产率[OR=0.976，95%CI(0.956，0.996)，P<0.05]。同样的移植D5胚胎比例和优质胚胎的个数对活产率有影响，移植全部不为D5(移植全为D6)胚胎相对于移植全部为D5胚胎的活产率降低(P=0.000)，移植1个优质胚胎和2个优质胚胎相对于移植0个优质胚胎活产率增加(P=0.000)(表4)。

四、活产情况比较

各组活产情况比较结果：≥6年组活产24例，单胎率[75%(18/24)]高于其他组，出生男孩比例[60%(18/30)]高于其他组，出生缺陷发生率为0，低于或等于其他组。经卡方检验，各组活产的单胎率、出生男孩比例和出生缺陷发生率均无统计学差异(P>0.05)(表5)。

五、单胎新生儿出生结局比较

各组单胎新生儿出生结局：≥6年组单胎18例，单胎出生体重(3 348.33±480.89)g，单胎身长(50.00±1.91)cm，孕天数为(267.72±13.84)d；经单因素方差分析，各组的单胎出生体重，单胎身长和孕天数无统计学差异(P>0.05)(表6)。

表4 影响活产率因素的Logistic回归结果

表5 各组冷冻复苏移植活产情况比较(%)

表6 各组冷冻复苏移植单胎新生儿出生结局比较(-±s)

讨 论

胚胎冷冻保存技术是辅助生殖技术最重要的衍生技术。大部分IVF周期在新鲜移植后都会剩余胚胎，有的患者因子宫或其他疾病不能进行新鲜周期移植，此时便需要将胚胎冷冻保存或者将胚胎培养至囊胚阶段并冷冻保存。胚胎冷冻保存有利于提高单个取卵周期的胚胎利用率和累积妊娠率，减少胚胎移植数量，降低多胎的发生率，降低患者的治疗费用，避免了新鲜周期移植可能会出现的卵巢过度刺激综合征。而且对于因子宫肌瘤、内膜病变等病情需要的患者，需要冷冻保存胚胎后，经过治疗妇科疾病后再进行移植[1]。囊胚培养虽然会减少可用胚胎的数量，但是一定程度上可以淘汰掉染色体异常等质量差的胚胎，进一步筛选出发育潜能好的胚胎[4]。所以囊胚冷冻复苏移植有重要的临床应用价值。

根据理论模型，哺乳动物配子和胚胎可以冷冻储存几千年依旧保持生命力[5]。一项大型队列研究结果表明，使用封闭的玻璃化冷冻载体冷冻保存胚胎的时长对存活、植入、活产、新生儿结局和先天畸形没有明显的负面影响[6]，但是，目前有很多实验室使用开放的冷冻载体多过封闭载体[7]。之前有研究称，当使用开放冷冻系统保存卵母细胞时，保存的时长对临床结果没有明显的负面影响，但是没有明确对新生儿结局的影响[8]。还有研究探讨了使用开放系统玻璃化冷冻保存时长对卵裂期胚胎的影响，结果显示保存时间5年内不影响胚胎存活率和妊娠结局[9]。最近的一项大型队列研究报告结果显示，使用开放系统长期保存囊胚对妊娠和新生儿结局没有明显负面影响，但是该研究的局限性在于最大储存期为8年，而且并未将≥6年的资料单独列出[10]。本研究旨在探讨使用开放冷冻保存系统情况下，囊胚玻璃化冷冻保存时长对复苏移植妊娠结局和新生儿结局的影响，进一步探讨超过6年的玻璃化冷冻保存是否对胚胎的临床结局有影响。

有研究表明冷冻复苏细胞的存活率随着低温储存时间的延长而下降[11]。本研究结果显示，保存时间1～2年组的存活率最低，为97.19%，而5～6年组和≥6年组的存活率都为100%，说明冷冻复苏胚胎的存活率并不会随着储存时间的延长而下降；虽然1～2年组的优胚率不是最低，但是还是稍稍低于总体优胚率，所以各组冷冻复苏胚胎的存活率可能与胚胎的质量或者其他因素有关系。但由于本中心绝大多数冷冻方式是两个胚胎冷冻在一个载杆内，而且复苏后的培养也为集合培养，无法准确地追踪不同胚胎的复苏存活情况，所以无法进一步分析影响胚胎复苏存活率的因素。收集更多单胚胎冷冻复苏移植的资料，并分析其复苏存活率的影响因素是我们今后的研究方向。

本研究中各组临床妊娠率和活产率在不同冷冻保存时间组有差异，由于患者基础情况中取卵年龄、移植年龄和移植优胚率都有差异，所以并不能判断是否是玻璃化冷冻保存时长的差别导致了各组妊娠率和活产率的差异。于是进一步使用二分类Logistic回归分析影响妊娠率和活产率的因素。结果显示，取卵年龄、移植年龄和冷冻保存时长对妊娠率没有显著影响，而增加移植D5胚胎和优质胚胎数量可以提高妊娠率，与以往研究D5冻融囊胚的临床妊娠率显著高于D6冻融囊胚临床妊娠率[12]的结论一致。取卵年龄、冷冻保存时长对活产率没有显著影响，而降低移植年龄、增加移植D5胚胎和优质胚胎数量可以提高活产率，与以往研究中活产率与囊胚冷冻日期(D5或D6)有关而与冷冻保存时间长短无关的结论一致[10]。但是在其他研究中囊胚直径[10，13]、既往胚胎移植次数[10，14]已经被证明与胚胎移植后的活产有关。在本研究中这些数据因资料的缺失并没有提供，今后可以收集这方面资料，完善研究。对于≥6年组的资料，其优胚率(84.42%)远高于总体优胚率(69.56%)，所以临床妊娠率(59.10%)和活产率(54.55%)均高于总体临床妊娠率(56.11%)和活产率(47.22%)。

此外，本研究还发现使用开放性载体玻璃化冷冻保存囊胚的时长对新生儿结局没有负面影响。各冻存时长组间出生缺陷率、单胎出生体重、出生身长和孕天数没有统计学差异，而且≥6年组的出生缺陷发生率低于其他各组。以往的研究中报道过胚胎冷冻保存会增加孕周增长的风险，可能与表观遗传修饰和胚胎培养环境的变化有关[15]，但是本研究结果表明，各组之间的孕天数并没有明显的差异，冷冻保存时长的延长并没有增加孕天数，≥6年组的孕天数(267.72±13.84)d，甚至略低于其他各组。

玻璃化冷冻与程序冷冻相比，需要设备少，节省人力，胚胎复苏存活率高[16]，越来越多的生殖中心使用这种方法冷冻胚胎。但是由于玻璃化冷冻采用的冷冻保护剂浓度高，一直以来都有对于安全性的顾虑。虽然国内外还未有玻璃化冷冻复苏周期出生缺陷增多的报道[17]，但是动物研究表明，玻璃化会影响基因的表达和表观遗传状态，包括在牛和小鼠玻璃化囊胚中降低启动子甲基化[18-19]。所以对玻璃化冷冻复苏周期出生胎儿进行长期随访，从而进一步研究其安全性是今后研究的方向。

在实际工作中，还有很多因素可能会影响到冷冻胚胎的复苏结果，例如冷冻保存过程中反复打开液氮储存罐、冷冻载体的更新换代、冷冻复苏操作程序的改进等等。本研究都没有排除这些因素对结果的影响。本研究的另一个局限是其回顾性，可能会增加患者选择的偏倚。

综上所述，基于目前我们的研究，使用开放性载体玻璃化冷冻保存囊胚的时长对复苏后移植的妊娠结局和新生儿结局没有明显影响。囊胚冷冻日期和囊胚质量才是影响临床结局的因素。囊胚经过玻璃化冷冻并进行6年以上长期冷冻保存，临床结局未产生明显负面影响。