圆红冬孢酵母脂肪酸合酶的生物信息学分析

康 静，刘玉青，胡焕焕,丰慧根

(新乡医学院 生命科学技术学院，河南 新乡453003)

基于生物质转化生产的生物柴油是当今最为理想的可再生燃料之一[1]。圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)是目前研究较多的高产油脂菌种，作为生物柴油的原料，与藻类或植物生物柴油相比，它可在胞内积累油脂、类胡萝卜素等[2]，它不仅是清洁能源，更具有可持续生产微生物类脂和工业化广泛应用的潜力。该菌株经酯交换产生生物柴油[3]，但反应速率慢，反应体系中过多的甲醇和副产物甘油还会影响脂肪酶的活性及稳定性[4]。对圆红冬孢酵母油脂代谢中的关键酶脂肪酸合酶(Fatty acid synthase，FAS)的结构特征及理化性质进行预测，可以为下一步构建产油工程菌奠定基础，也为生物柴油及其他相关行业的原料油脂资源和废弃物的再利用提供新的思路[5]。

1 材料与方法

1.1 FAS基因序列的Genbank检索

在NCBI的Genbank数据库中检索圆红冬孢酵母脂肪酸合酶，其基因序列编码为XM_016415817.1，氨基酸序列编码为XP_016272387.1。

1.2 FAS的生物信息学分析及预测

1.2.1 构建系统进化树

在NCBI数据库中检索20种生物FAS氨基酸序列，利用MEGA7.0软件对20种生物相应的氨基酸序列进行遗传距离的分析，构建出FAS的系统进化树。

1.2.2 使用在线生物信息学预测工具

ProtParam：对FAS进行理化性质的预测，如分子量、等电点、原子构成、氨基酸组成、摩尔消光系数、半衰期、脂溶指数等；ProtScale：对FAS进行亲水参数的预测；TMpred：对 FAS 进行跨膜区域的预测；SigalP：对FAS进行信号肽的预测；PredictNLS：对FAS进行核输出信号的预测；SOPMA和PredictProtein：对FAS进行蛋白质二级结构折叠类型的预测分析；SMART：对FAS进行蛋白质结构域的预测与分析。

2 结果

2.1 FAS进化树的构建

使用邻位相连法(Neighbor-joining，NJ 法)构建FAS的系统进化树，如图1所示。将20种FAS的氨基酸序列对齐后，使用软件MEGA 7.0构建系统进化树。由图1可知，该FAS与红酵母属的菌种都具有较高同源性，且进化位置上也比其他菌种要高。

图1 圆红冬孢酵母FAS系统进化树

2.2 氨基酸的组成

利用在线软件Protparam对该FAS编码的氨基酸组成进行初步预测分析。如图2所示，预测结果：该FAS编码区的氨基酸数目为2928个，其中含量较多的氨基酸为Ala(311个，10.6%)，Leu(260个，8.9%)和Gly(250个，8.5%)。该FAS氨基酸中，带正电的总数残基/酸性氨基酸(Arg+Lys=320)少于带负电的总数残基/碱性氨基酸(Asp+Glu=338)[6]。它还含有17个半胱氨酸，说明该蛋白可能具有二硫键。它没有Pyl(O)Sec(U)(B)(Z)(X)氨基酸。该FAS的氨基酸组成分别为：Ala(10.6%)，Arg(4.5%)，Asn(3.0%)，Asp(5.0%)，Cys(0.6%)，Gln(4.0%)，Glu(6.5%)，Gly(8.5%)，His(1.9%)，Ile(5.4%)，Leu(8.9%)，Lys(6.4%)，Met(2.3%)，Phe(3.5%)，Pro(4.9%)，Ser(6.7%)，Thr(6.1%)，Trp(1.1%)，Tyr(3.1%)以及Val(7.0%)。

图2 圆红冬孢酵母FAS的氨基酸组成分布图

2.3 蛋白质的理化性质

利用在线软件ProtParam对FAS理化性质的各个参数进行初步预测分析，得到结果如下：该蛋白的原子构成为C14186H22484N3858O4275S84，原子总数44887，相对理论分子量为318178.90道尔顿，理论等电点pI值为6.39。对于该蛋白的摩尔消光系数(Molar Extinction Coefficient)，以M-1cm-1为单位，在水中280nm处测定。假设该FAS所有的胱氨酸残基以半胱氨酸的形式出现，即形成二硫键，此时该蛋白的消光系数值为312590L/(mol·cm)，0.1%浓度(1g/L)的吸光度(A280)为0.982；假设二硫键全部打开，该蛋白的消光系数值为311590L/(mol·cm)，0.1%浓度(1g/L)的吸光度(A280)为0.979[6]。当其成熟肽N端为Met甲硫氨酸时，FAS的估计半衰期在体外哺乳动物网织红细胞为30h，在酵母体内半衰期大于20h，在大肠杆菌体内半衰期大于10h。该蛋白的不稳定系数为38.47，可知该FAS为稳定蛋白(定义当蛋白质的稳定系数<阈值40时，其在溶液中性质稳定)。该蛋白脂肪指数为86.64，亲水性为-0.199。对于蛋白质的疏水性/亲水性，定义为氨基酸序列中全部氨基酸的亲水值总和与氨基酸数量的比值。负值越大亲水性越好，正值越大疏水性越强。该FAS亲水性负值，表明此蛋白为亲水性蛋白。

2.4 疏水性分析

蛋白质疏水性/亲水性的预测和分析是进行蛋白质二级结构预测及功能域划分的一个必要过程[6]。运用在线软件ProtScale来预测该FAS氨基酸序列的疏水性/亲水性。由图3得预测结果：该FAS多肽链中，第2316位的氨基酸Arg(R)具有最低分值-3.178，第1919位的氨基酸Gly(G)具有最高分值2.400。依据氨基酸分值越低亲水性越强，分值越高疏水性越强的规律，可以看出第2316位的Arg亲水性较强，第1919位的Gly疏水性较强。整个肽链中亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，因此整个多肽链表现为亲水性，可判断该FAS是亲水性蛋白。

图3 FAS疏水性预测分析结果

2.5 FAS跨膜预测

用TMpred工具对该FAS氨基酸序列的跨膜结构域进行预测。横轴为氨基酸位置，纵轴为跨膜预测得分值，定义预测分值低于500，显示不具有跨膜结构。从图4中可得，对该FAS氨基酸序列跨膜的预测分值有多个超出500，因此推测该蛋白具有跨膜结构。

图4 FAS跨膜预测结果

2.6 信号肽分析

使用SignalP对该FAS进行信号肽预测，得出该FAS的Signal peptide probability预测值为0.167，小于临界值，未发现信号肽序列(图5)，因此推算该FAS为非分泌性蛋白(Non-secretory protein)。

图5 FAS信号肽预测图

2.7 FAS核输出信号分析

使用PredictNLS进行核输出信号预测。从图6中可得该蛋白的核输出信号(nuclear expotr-signal，NES)分值中有超过阈值的，因此可以认为该蛋白质具有核输出信号。

图6 FAS的核输出信号预测结果

2.8 蛋白质的二级结构分析

对该FAS的二级结构进行预测，结果显示该FAS可能包含的二级结构及各个数据分别为α-螺旋1302个，占44.47%；β-折叠418个，占14.28%；β-转角184个，占6.28%；无规则卷曲1024个，占34.97%。α-螺旋及无规则卷曲是FAS二级结构中最大量的结构元件，而β-折叠和β-转角则散布于整个蛋白质中。

2.9 蛋白质的结构域分析

利用SMART软件在线预测该FAS的结构域，分别是位于第87到第210位氨基酸以及第364到第480位氨基酸的脱水酶(Dehydratase)结构域，位于第495到第872位氨基酸的乙酰转移酶(Acetyl transferase)结构域，位于第2218到第2444位氨基酸以及第2541到第2662位氨基酸的酮酰合酶(Ketoacyl synthase)结构域，位于第2812到第2924位氨基酸的4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(Phosphopantetheinyl transferase，PPTase)结构域。

3 讨论

脂类作为生化大分子的一员，可以说它已经不仅仅是组成微生物细胞膜的重要部分，还是生物体细胞内许多重要生化反应的参与者和调节者。它构成了细胞的完整性并参与了免疫防御机制[7,8]。

生物油脂作为一种生活中的保健食品，其反应作用已经有较多学者进行研究。随着不断出现的各种多不饱和脂肪酸(GLA，EPA，DHA，AA)在抗肿瘤、抗衰老、降血脂、降糖等方面作用的逐步研究，微生物油脂的应用有十分广阔的市场和值得期待的前景[9]。

在对新能源的开发中，生物柴油作为主要能源备受瞩目。它作为与现有石化柴油非常相似的能源，是将甘油三酯转脂化得到的脂肪酸甲脂(或乙脂)，其原料可再生产，且属于清洁能源，成本上也不用经常更换和清洗发动机，其分析方法也多种多样，因此受到广泛关注[10]。目前生产生物柴油的原料主要为植物油或废弃食物油，其生产依赖植物油脂资源。

在适宜条件下，某些微生物可在体内积累单细胞油脂，例如细菌、酵母和藻类等，尤其是产油脂酵母生长速率快，油脂含量高[11]。圆红冬孢酵母产生的油脂具有与植物油类似的脂肪酸组成，是生物柴油生产的潜在替代品。它作为脂滴细胞生物学和可持续化学生产的模型具有巨大潜力。利用生物发酵的方法生产脂肪酸及其衍生物被认为是一种可再生且环境友好的生产模式[12]。

本实验对圆红冬孢酵母油脂代谢生化反应中重要的脂肪酸合酶进行生物信息学分析，通过研究该蛋白的理化性质及结构特征，以便预测其在油脂代谢中所起到的作用，并为下一步构建产油工程菌奠定基础。