木本油料文冠果APETALA2基因全长cDNA序列与生物信息学分析

刘晓辉+马静怡+罗媛+李志民+王莉

摘要 文冠果是我国北方特有的木本油料树种。AP2是植物种子发育调控的重要转录因子。根据已获得的文冠果转录组数据搜索文冠果AP2基因序列（XsAP2），并对XsAP2基因全长cDNA序列进行生物信息学分析。结果表明，XsAP2基因cDNA序列包含1个长度为1 548 bp的完整ORF，编码515个氨基酸。XsAP2蛋白大部分区域为亲水区，由136个ɑ螺旋、89个延伸链、43个β-转角、247个无规则卷曲构成。依据2gcc.1.A同源建模法，获得1个三级结构模型，该模型从第153个氨基酸开始到第213个氨基酸结束。XsAP2蛋白与9种其他植物AP2蛋白的同源性分析显示，文冠果AP2与可可AP2的同源性最高（71%）。该结果可为解析文冠果种子生长发育的分子调控机制提供理论依据，并有助于文冠果油品质改良和文冠果分子育种工作。

关键词 文冠果；APETALA2基因；cDNA；亲水性；ɑ螺旋；同源性

中图分类号 S794.9 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）02-0145-02

文冠果是我国北方特有的木本油料树种，其种仁含油量高达50%～70%，富含油酸、亚油酸、神经酸等优质不饱和脂肪酸[1]，是国家“十三五”期间大力发展的新型健康木本食用油，在许多工业领域如制药与生物质能源等方面也具有重要的用途。因此，挖掘调控文冠果种子发育的重要转录因子基因，对提高文冠果种子产量和含油量具有重要意义。

AP2/ERF转录因子是植物最大的转录因子家族之一，含有1～2个保守的AP2/ERF结构域[2-3]。其中AP2亚家族转录因子主要参与植物花、果实和种子等器官生长发育的调控[4]。APETALA2是AP2亚家族的成员之一，已相继在拟南芥、水稻和葡萄等物种中分离出来[5]，而在文冠果中AP2转录因子方面的研究还较少。因此，本研究在测序获得的转录组数据中筛查文冠果APETALA2（AP2）基因的全长cDNA序列，通过生物信息学方法分析AP2转录因子的结构特征及功能，为解析文冠果种子生长发育的分子调控机制提供依据，有助于文冠果油品质改良和文冠果分子育种工作。

1 材料与方法

1.1 搜索转录组获得新基因序列

从本研究室测序获得的文冠果根、茎、叶的de novo转录组数据中搜索获得文冠果AP2基因的cDNA序列。

1.2 文冠果AP2基因cDNA序列的生物信息学分析

利用ORFfinder在线软件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）预测XsAP2基因cDNA序列的ORF。采用Prot-Param在线软件（http：//web.expasy.org/protparam/）预测XsAP2蛋白序列的一级结构。通过ProtScale在线软件（http：//web.expasy.org/protscale/）分析XsAP2蛋白的疏水性/亲水性。利用SOPMA在线软件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_ sopma.pl）预测XsAP2蛋白序列的二级结构。采用SWISS-MODEL软件（http：// www.swissmodel.expasy.org/）预测XsAP2蛋白的三级结构。

1.3 文冠果AP2蛋白与其他植物AP2蛋白氨基酸序列的同源性比较

从NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載9种植物（可可、甜橙、葡萄、木本棉、木薯、千年桐、土瓶草、陆地棉和麻风树）的AP2氨基酸序列。然后利用DNAMAN软件将文冠果和9种其他植物的AP2氨基酸序列进行同源性比对。

2 结果与分析

2.1 文冠果XsAP2基因cDNA序列的ORF预测

依据本实验室已获得的文冠果转录组数据，搜查获得文冠果AP2基因的全长cDNA序列。使用ORF Finder软件，根据标准遗传代码查找XsAP2的开放读码框（ORF），结果显示，AP2基因ORF序列长度为1 548 bp，可编码515个氨基酸（图1）。

2.2 XsAP2基因编码蛋白质一级结构预测

利用ProtParam在线软件对XsAP2基因编码的蛋白质的结构预测见表1。XsAP2蛋白分子式为C2482H3827N755O801S16，相对分子质量为57 572.23，等电点为6.38，蛋白质不稳定系数为60.47。

2.3 XsAP2蛋白疏水性/亲水性分析

利用ProtScale在线软件对XsAP2蛋白序列进行疏水性/亲水性预测，根据线性质量差异模型，得到蛋白质亲疏水性信号（图2）。图2中可见XsAP2蛋白的疏水性最大值为0.989，最小值为-3.511，总体来看XsAP2大部分氨基酸属于亲水性氨基酸。

2.4 XsAP2蛋白序列的二级结构预测

基于蛋白质数据库，利用SOPMA在线软件对XsAP2蛋白序列进行二级结构预测（图3）。结果表明，XsAP2蛋白由136个ɑ螺旋、89个延伸链、43个β-转角、247个无规则卷曲构成，分别占据26.41%、17.28%、8.35%、47.96%，即XsAP2蛋白质无规则卷曲所占比例最高。因此，可以推测文冠果XsAP2蛋白质二级结构中最大量的结构原件是以无规则卷曲的形式存在，ɑ螺旋、β-转角和延伸链分散在整个蛋白质中。

2.5 XsAP2蛋白序列的三级结构预测

使用同源建模法，将文冠果AP2蛋白序列提交至SWISS-MODEL，见图4。依据2gcc.1.A同源建模法，获得1个三级结构模型（图4），该模型从第153个氨基酸开始到第213个氨基酸结束。该蛋白质主要由无规则卷曲、ɑ螺旋、β-转角和延伸链组成，三级结构预测与二级结构预测的结果基本一致。endprint

2.6 文冠果XsAP2蛋白序列与其他植物AP2蛋白序列的同源性比较

文冠果XsAP2氨基酸序列提交NCBI在线比对，选择与其同源性较高的9种植物的AP2氨基酸：可可AP2（Theobroma cacao，XP_007047337）、甜橙AP2（Citrus sinensis，KDO79131）、葡萄AP2（Vitis vinifera，XP_010652782）、木本棉AP2（Gossypium arboretum，XP_017627516）、木薯AP2（Manihot esculenta，OAY 35492）、千年桐AP2（Vernicia montana，APQ47383）、土瓶草AP2（Cephalotus follicularis，GAV88830）、陆地棉AP2（Gossy-pium hirsutum，XP_016679121）、麻风树AP2（Jatropha curcas，XP_012079274）。使用 DNAman 软件将这些序列进行比对，发现不同植物的氨基酸序列同源性较高，其中文冠果与可可的同源性最高，达到71%。

3 结论与讨论

文冠果XsAP2蛋白是AP2/ERF转录因子家族成员之一，有研究报道在牡丹AP2蛋白中存在2个AP2/ERF结构域[6]，这2个结构域在不同物种中具备很高的保守性。本研究通过将文冠果AP2氨基酸序列与NCBI Nr数据库中其他植物的AP2氨基酸序列进行同源性比较，发现文冠果XsAP2与可可、甜橙、葡萄、千年桐、陆地棉、麻风树等9种植物均有较高的同源性，其中与可可的同源性最高（71%），与甜橙和陆地棉的同源性相对较低（66%）。这说明文冠果与其他高等植物在AP2氨基酸序列上存在较长的保守区域，且保守区域为2个AP2/ERF结构域，从而在进化上相对较为保守。本研究通过搜索文冠果转录组数据获得文冠果AP2/ERF家族转录因子，对开展文冠果高油新品种分子育种工作提供重要参考价值，也为下一步利用试验方法研究该基因的结构功能方面奠定基础[7]。

4 参考文献

[1] 赵娜，张媛，李秋琦，等.文冠果FAD2的序列与功能分析[J].北京林业大学学报，2015，37（2）：87-93.

[2] ZHANG C H，SHANDGUAN L F，MA RJ，et al.Genome-wide analysis of the AP2/ERF superfamily in peach（Prunus persica）[J].Genet Mol Res，2012，1：4789-4809.

[3] DIETZ K J，VOGEL M O，VIEHHAUSER A.AP2/EREBP transcription factors are part of gene regulatory networks and integrate metabolic，hormonal and environmental signals in stress acclimation and retrograde signaling[J].Protoplasma，2010，245：3-14.

[4] OKAMURO J K，CASTER B，VILLARROEL R，et al.The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins in Arabidopsis[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94：7076-7081.

[5] LICAUSI F，GIORGI F M，ZENONI S，et al.Genomic and transcriptomic analysis of the AP2/ERF superfamily in Vitis vinifera[J].BMC Genomics，2010，11：719.

[6] 任磊，王雁，周琳，等.牡丹PsAP2基因的克隆及表達[J].林业科学，2011，47（9）：50-56.

[7] 敖妍，段劼，于海燕，等.文冠果研究进展[J].中国农业大学学报，2012，17（6）：197-203.endprint