槐耳颗粒抑制肺腺癌细胞增殖和迁移的机制研究

吴 迪，吴雨琼，乔轶才，孙一航，王 潞，吴志浩

(1.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 肿瘤内科,安徽 芜湖 241001；2.皖南医学院 a.临床医学院；b.影像学院；c.医学生物学教研室，安徽 芜湖 241002)

肺癌是世界上最常诊断的癌症(占总病例数11.6%)且居癌症死亡首位(占癌症总死亡人数的18.4%)[1]。肺癌的常规治疗包括手术、放疗和化疗。大多数患者对化疗毒性和高昂的价格难以承受，需寻找成本相对低廉或无毒的药物[2]。槐耳(Huaier，HE)作为传统中药，其抗癌作用近年来引起了全世界的兴趣[3]。临床应用已证实其抗癌效果,对肝癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤具有一定的疗效。上皮-间充质转换(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是癌症转移的关键步骤，它是一个动态过程，可以降低组织的黏附能力，驱使细胞运动的发生[4]。E-cadherin表达降低是EMT的发生标志，Snail是第一个被发现和最重要的E-cadherin转录抑制因子[5]。本研究对槐耳颗粒抑制肺腺癌细胞的增殖和迁移作用进行了探讨,为以后的临床治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人非小细胞肺癌细胞系A549、H1299，受赠于中国科学院细胞库。

1.1.2 主要试剂及仪器 金克槐耳颗粒(启东盖天力药业有限公司，批号：Z20000109，规格：20 g×6袋/盒)，DMEM培养基(Hyclone)，小牛血清(GIBCO)，1.5 mol/L Tris-HCl(pH=8.8)、1 mol/L Tris-HCl(pH=6.8)、APS、TEMED(Beyotine)，NC膜(PALL)，四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)、DMSO、丽春红(Sigma)，细胞培养箱(Eppendorf)，低温水平摇床(New Brunswick)，电泳仪、小型垂直电泳槽(Bio Rad)，金属浴D1100-230V(Labnet AccuBlock)，化学发光显影成像系统(GE)，BioTek酶标仪(伯腾公司)，流式细胞术试剂盒、流式细胞仪(BD)，抗体β-actin(Sigma)，抗体Snail、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin、兔抗、鼠抗(CST)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞H1299和A549在37℃、5%CO2的培养箱中培养。用10%小牛血清的培养基每1～2 d换液。在细胞对数生长期时用0.25%的胰酶消化，用于目的实验。细胞经槐耳处理前，行过夜饥饿。

1.2.2 槐耳溶液配制 电子天平称槐耳颗粒1g，溶于50 mL DMEM培养基中，配成20 mg/mL浓度药液。37℃磁力搅拌器上搅拌2～3 h，充分溶解后，用0.22 μm滤过器过滤，4℃备用，使用时用培养基稀释。

1.2.3 MTT实验 细胞接种于96孔板中，长至80%～90%密度，加入0、2、4、6、8、10 mg/mL的槐耳处理24或48 h，各样本设4组复孔，另设空白对照和细胞对照。加入新配制的0.5 mg/mL MTT溶液200 μL/孔，处理3～4 d后吸去上清，加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL/孔，摇床避光震荡10 min。酶标仪测定490 nm处吸光度。根据公式：细胞抑制率(inhibitor rate，IR)(%)=(对照组吸光度值-实验组吸光度值)/对照组吸光度值×100%计算每组抑制率。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI双染细胞流式术 细胞均匀铺在6孔板中，长至80%～90%，饥饿过夜，给予槐耳(0、10 mg/mL)孵育24 h。收集旧的培养液，PBS洗3次，0.25%胰酶(不含EDTA)消化3 min，加培养基，吹打成悬液，2000 r/min×5 min离心，弃上清，预冷的PBS洗2次，离心后弃上清，调整每管细胞密度为(1～5)×105个。加入100 μL Binding Buffer/管后，加5μL FITC/管，混匀，再加入5 μL PI/管，混匀，最后再加400 μL Binding Buffer/管。室温下避光反应5～15 min。1 h内用流式细胞仪检测。并用Flowjo7.6软件分析。

1.2.5 细胞划痕实验 6孔板中细胞密度达80%～90%时，用灭菌的200 μL无核酸酶枪头划一条均匀的直线，PBS洗去漂浮细胞。分别加入0、5、10 mg/mL的槐耳，倒置显微镜100倍放大率下观察细胞的迁移情况并拍照(时间0 h)。将细胞进一步与DMEM一起孵育24或48 h并再次拍照。计数迁移至0 h伤口区域的细胞数。划痕伤口宽度=各时间段伤口面积/0 h伤口面积×100%。

1.2.6 Western blot实验 六孔板中细胞密度达80%～90%时，饥饿过夜。加入0、2、4、6、8、10 mg/mL的槐耳处理24 h后，蛋白收样。取1×Laemmli sample buffer，放入100℃金属浴中，煮2～5 min。取6孔板，1×PBS洗细胞，每孔加80 μL 1×Laemmli sample buffer，将收集的蛋白产物于100℃金属浴中加热8 min后，80V电泳分离蛋白，转膜。丽春红染色后，封闭1 h，4℃孵一抗过夜。次日，洗一抗3次，5 min/次，室温孵二抗2 h，洗二抗3次，5 min/次，曝光，Image J分析灰度值。按上述方法提取蛋白样品进行三次独立实验。

1.2.7 乳酸实验 六孔板中细胞长至80%～90%时，饥饿过夜。用0、2、4、6、8、10 mg/mL的槐耳处理24 h，加入终浓度为0、10、20 mmol/L的乳酸，处理3 h后收样。

2 结果

2.1 槐耳颗粒能抑制肺腺癌细胞增殖 MTT结果显示A549中，24 h IC50=7.6 mg/mL，48 h IC50=6.41 mg/mL；H1299中，24 h IC50=7.54mg/mL，48 h IC50=7.01mg/mL。A549的增s高，除2 mg/mL组外，48 h的抑制率均高于24 h。H1299中，24 h时除浓度8 mg/mL与6 mg/mL组比无意义外，其余抑制率随浓度的升高而升高；当浓度为6 mg/mL至更高时，48 h抑制率均高于24 h(见表1)。P<0.05为差异有统计学意义。

表1 A549和H1299中槐耳处理24 h和48 h时对细胞增殖的影响(n=3)

HE/(mg/mL)A54924 h48 htPH129924 h48 htP00.00±0.000.00±0.00--0.00±0.000.00±0.00--225.86±2.07a27.30±1.07a1.0690.34520.37±1.54a15.97±1.92a3.0960.036434.31±1.16b41.81±2.15b5.3710.00628.50±0.81b25.15±2.69b2.0650.108638.67±1.25c48.61±0.29c13.4200.00038.33±0.62c46.82±1.28c10.3400.001848.24±1.16d58.00±1.58d8.6240.00141.30±1.7154.28±1.83d8.9760.0011062.84±2.79e73.40±1.45e5.8170.00454.33±1.91e66.09±1.56e8.2600.001F500.8001125.000642.800620.500P0.0000.0000.0000.000

注：2与0比较，aP<0.05；4与2比较，bP<0.05；6与4比较，cP<0.05；8与6比较，dP<0.05；10与8比较，eP<0.05。

2.2 槐耳可促进肺腺癌细胞凋亡 与对照组相比，槐耳组早调、晚调及总凋亡细胞数增加(见图1和表2)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 槐耳对肿瘤细胞的迁移有抑制作用 划痕结果显示，迁移细胞数随时间的延长而增加。与对照组相比，同时间段槐耳组的细胞迁移被显著抑制，且10 mg/mL组比5 mg/mL组效果更明显(见图2、表3)，P<0.05为差异有统计学意义。

2.4 槐耳能抑制肿瘤细胞EMT蛋白的表达 Western blot结果显示，与对照组相比，槐耳组上皮标记蛋白E-cadherin表达增高，间充质标记蛋白N-cadherin、Vimentin及EMT核心蛋白Snail表达量均降低(见图3和表4、5)。P<0.05为差异有统计学意义。

表2 A549和H1299细胞中槐耳组与对照组相比凋亡细胞数变化(n=3)

A549对照HE/(10 mg/mL)tPH1299对照HE/(10 mg/mL)tP早凋4.38±0.246.75±0.507.4010.0027.70±0.9516.70±0.6113.8100.000晚凋5.26±0.7933.00±1.2831.9400.0006.64±0.8341.80±1.6532.9700.000凋亡总数9.64±1.0339.75±1.7725.4700.00014.34±1.7758.50±2.2626.6400.000

表3 A549和H1299细胞中槐耳对迁移的影响(n=3) mg/mL

注：24 h与0 h比，aP<0.05，48 h与24 h比，bP<0.05；浓度(mg/mL)5与0组比，cP<0.05，10与5组比，dP<0.05。

图1 流式细胞术检测槐耳处理后对肺癌细胞A549和H1299凋亡的影响

图2 在10×10倍倒置显微镜下划痕结果

图3 不同浓度槐耳处理细胞24 h的Western blot结果

表4 A549细胞中不同浓度槐耳处理后各蛋白表达量变化(n=3) mg/mL

表5 H1299细胞中不同浓度槐耳处理后各蛋白表达量变化(n=3) mg/mL

2.5 槐耳能抑制乳酸诱导的细胞内源性Snail表达增多 Western blot结果表明，无槐耳作用时，除H1299中乳酸20 mmoL/L与10 mmoL/L比较无意义外，内源性Snail表达均随乳酸浓度升高而增加。而槐耳能有效抑制这种升高的内源性Snail表达(见图4和表5)。P<0.05为差异有统计学意义。

图4 Western blot结果显示槐耳颗粒能够抑制乳酸诱导的内源性Snail蛋白表达

表6 H1299和A549细胞中乳酸条件下槐耳对Snail蛋白的影响(n=3)

乳酸/(mmol/L)H1299HE(0 mg/mL)HE(10 mg/mL)tPA549HE(0 mg/mL)HE(10 mg/mL)tP00.71±0.040.59±0.024.6480.0100.58±0.040.45±0.025.1060.007101.62±0.03a0.76±0.04a29.7900.0000.85±0.02a0.63±0.01a19.0700.000201.69±0.031.12±0.08b11.5600.0031.10±0.02b0.68±0.02b30.1900.000F791.20078.460320.000133.200P0.0000.0000.0000.000

注：10与0组比较，aP<0.05；20与10组比较，bP<0.05。

3 讨论

肺癌是我国癌症死亡的主要原因，且病死率随着年龄的增长而递增[6]。它分为两大类：小细胞肺癌(SCLC，占所有肺癌的15%)和非小细胞肺癌(NSCLC，占所有肺癌的85%)。NSCLC可进一步分为鳞状细胞癌(SCC)，大细胞癌(LCC)和腺癌(AC)[7-8]。由于其具有侵袭性生物学特性且缺乏有效筛查方案,NSCLC患者在诊断时基本已达晚期。肿瘤的治疗方法诸多,但治疗效果差强人意,且副作用较大。因此，生物医学科学迫切需要开发副作用小、耐药性低的新型抗癌剂以满足癌症患者的治疗需求[9]。槐耳是一种药用真菌，作为中药已应用了约1600年。大量临床应用表明，槐耳具有良好的抗肿瘤作用,其有效成分主要为多糖蛋白(PS-T)[10]，然而其抗肿瘤的机制尚不明确。EMT与肿瘤的发生、发展、转移密切相关。有数据显示超过90%的癌症死亡与肿瘤转移的发生有密切联系[11]。转录因子Snail作为C2H2型的一类锌指蛋白,主要通过SNAG结构域和共抑制子C端结合蛋白组成转录抑制区域，实现对基因表达的抑制,在EMT过程中发挥重要的调控作用。Snail蛋白水平与病理性肿瘤分期和组织学分级呈正相关，在侵袭和转移中具有重要作用，并且沉默该基因可能是肿瘤中潜在的治疗靶点[12]。我们知道细胞增殖是癌症发生、发展中不可或缺的过程，本研究中，我们通过MTT实验证实了槐耳能有效抑制A549及H1299细胞的增殖，与之前研究相符。流式细胞术结果也揭示槐耳能明显诱导肺腺癌细胞凋亡，我们可对此进一步深入研究，探讨其凋亡通路。同时，我们所进行的体外划痕测定实验，表明槐耳可能作为肺癌治疗的有效抗转移剂。接着，为探讨其作用机制，我们运用Western blot证明了槐耳可通过Snail抑制EMT发生过程进而影响肺癌细胞的迁移，同时乳酸实验也进一步证实了这一点。虽然本实验证明了槐耳具有抗癌潜力，为槐耳颗粒在肺部肿瘤治疗上提供一定的科学依据，开辟了更有效的抗癌治疗选择，但仍存在一些局限性，我们目前无法得到关于槐耳在人体中的吸收、分布、代谢和排泄的信息，后期应进一步开展相关临床研究，使得其作为一种前瞻性抗癌候选药物在治疗恶性肿瘤方面发挥益处。